Способ определения микроколичеств белка в растворах, содержащих детергенты

. - Апа 1 уу. 78, . ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИ Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬС(71) Институт биологичеАН СССР(56) БсЬаНпег У. апй ИА гарЫ, яепя 1 г 1 е апошегЬос 1 Гог где с 1 егегшпгедп ьп с 111 Ге яо 1 цс 1 опВз.осЬеш 1 яггу, 1973, ч.514,Мс 1 сп 8 М С. А со 1 ог 1Йог где с 1 егегшдпаг 1 оп оягаш сцапггхея оГ ргоггхса 1 Вхосйепаяггу. 197р. 86-92.(57) Изобретение относится к экспериментальной биологии и медицине иможет найти применение в любьи исследованиях, требующих определения микроколичеств белка. Целью изобретенияявляется повышение точности и сокращение времени проведения анализа, Дляэтого после денатурации белка кислотой образующийся осадок детергентоврастворяют 25-307-ным этанолом, белок собирают на фильтрах, окрашиваютамидочерным 10 Б, элюируют окрашенныйкомплекс и определяют оптическуюплотность раствора при 630 нм. 2 ил.,3 табл.Изобретение относится к экспериментальной биологии и медицине и может найти применение в любых исследованиях, требующих определения микроколичеств белка,Цель изобретения - повышение точности анализаи сокращение времениопределения белка в растворах, содержащих детергент. 10Изобретение заключается в том, чтопроводят кислотную денатурацию белка,нанесение его на фильтр, окрашиваниеспецифическим красителем, элюцию окрашенного комплекса с последующимколориметрированием, согласно предлагаемому способу образующийся при кислотной денатурации белка осадок детергентов растворяют этанолом в концентрации 25-307, после чего белоксобирают на фильтре,Подобранная концентрация этанола(25-307) растворяет осадки детергентов и не влияет на точность определения количества белка. Концентрация 25 этанола менее 257 не растворяет кислотонерастворимые осадки амфифильных соединений, концентрация этанола больше 307, нарушает структуру фильтра, что приводит кискажению результата, Так как белок собирают на фильтре путем фильтрации, а не за счет поглотительной способности Фильтра, то объем пробы, содержащей белок, не ограничен, Минимальное количество определяемого белка 0,5 мкг в любом объеме пробы.На фиг.1 представлен график зависимости влияния различных концентраций этанола на точность определения 40 белка; на фиг.2 - результаты построения калибровочных кривых.Точность (фиг.1) представляют как достоверное определение количеств белка в образце относительно стандар та (в качестве стандартного раствора используют раствор бычьего сывороточного альбумина) независимо от присутствующих агентов (различные концентрации и типы амфифильных соединений, этанол)Количество белка в пробе50 (стандартный раствор бычьего сывороточного альбумина) составляет 10 мкг. Из результатов, представленных на графике, следует, что этанол в концентрации 25-307 не влияет на точность определения количества белка в пробе относительно стандарта. При увеличении концентрации этанола выше 307, определяемое количество белка в пробе занижается.Результаты построения калибровочных кривых (фиг.2) представляют зависимость поглощения окрашенного комплекса при= 630 нм от количества белка в пробе для стандартного раствора бычьего сывороточного альбумина в присутствии различных детергентов (17-ный тритон Х, 17-ный саркозилат натрия, 17-ный цетавлон) и 257- ного этанола. Из представленных результатов следует, что, используя предлагаемый способ, можно достоверно определять микроколичества белка в присутствии детергентов относительно стандартного раствора белка.П р и м е р 1. Определение концентрации бычьего сывороточного альбумина в стандартном растворе, содержащем 17-ный тритон Х.Берут 10 мкл раствора белка концентрации 1 мг в 1 мл и вносят в 2 мл 17,-ного раствора тритона Х. Затем добавляют 0,5 мл 507-ного ТХУ. Для удаления образующегося осадка через 2 мин в пробу вносят 0,8 мп абсолютного этанола (конечная концентрация этанола 257). Осадок амфильного соединения исчезает и раствор фильтруют через мембранный фильтр БУИРОК Ф 6, предварительно промытый раствором, содержащим 57,-ный ТХУ и 257-ный этанол, После нанесения образца фильтр промывают дважды 2 мл раствора 57-ного ТХУ + 257-ный этанол, Далее фильтр нанизывают на нержавеющую проволочку и погружают для окрашивания в раствор амидочерного 10 Б (О, 17-ный амидочерный 10 Б в смеси метанол:ледяная уксусная кислота:НО = 45:10:45). Через 3 мин фильтр ополаскивают дистиллированной Н 0 (30 с), трижды по 1 мин в растворе метанол:ледяная уксусная кислота:НО = 90:2:8 и в течение 2 мин в дистиллированной Н О. Фильтр подсушивают фильтровальной бумагой, помещают в пробирки и заливают 2 мл элюирующего раствора (25 мМ ИаОН, 0,05 мМ ЭДТА в 507-ном этаноле). Через 10 мин окрашенный элюирующий раствор колориметрировали при длине волны= 630 нм.Аналогичные процедуры проводят с контрольным фильтром, на который наносят контрольную пробу, не содержащую белок. Окрашивание и промывку1404949 концентрации 257. растворяет осадок амфифильного соединения, образующийся при взаимодействии тритона Х(который содержится в образцах раствора 5белка) с ТХУ и, как видно из табл.не влияет на точность определения количеств белка в пробе. Таблица 1 Опыт 11 (+17 ный тритон Х и +257-ныйэтанол) Количество Контроль Опыт 1белка в про- (нет этанола (+257-ныйбе, мкг и тритона этанол)Х) 2 0,025+0,001 0,024+0,002 0,026+0,00 1 4 О, 051+0, 002 О, 053+0, 001 0,050+0, 002 10 О, 131+0, 002 О, 125+0, 003 О, 132+0, 001 20 0,245+0,003 0,251+0,002 0,247+0,004 В контрольных пробах (отсутствуеттритон Хи 257-ный этанол) иопытных (присутствует тритон Х и 257.-ный этанол или только 257-ныйэтанол) достоверно определяется идентичное количество белка.Таким образом, используя 257-ныйэтанол, можно достоверно (точно) определять микроколичества белка в присутствии тритона Х. Время проведения процедуры определения белка 35составляет 25 мин.П р и м е р 2. Определение концентрации белка в суспензии клеток,100 мкл лизата суспензии клетокасцита Эрлиха, получаемого путем 40растворения клеток (1,0 б10 клетокв 2 мл раствора, содержащего 8 М мо чевину, детергент (17-ный саркозилатнатрия в 10 мМ фосфатном буфере),вносят в 2,4 мп 107.-ный ТХУ.Далее процедуры определения количеств белка ведут как в примере 1,только используемая концентрация этанола 277.В результате проведенных исследований показано, что этанол в концентрации 277 растворяет осадок амфифильных соединений, образующийся при обработке пробы, белка ТХУ, и, следовательно, появляется возможность определить концентрацию белка в лизатесуспензии клеток, В качестве стандартного раствора белка используют бычий контрольного фильтра проводят одновременно с опытным Фильтром, содержащим белок. Опытный и контрольный фильтры нанизывают на одну проволочку и разделят друг от друга стеклянной бусинкой.В результате проведенных исследований быпо показано, что этанол в сывороточный альбумин, растворенный в растворе, содержащем 8 М мочевину, 17-ный саркозилат натрия в 10 мМ фосфатном буфере.100 мкл лизата суспензии клеток содержат 24 мкг белка. Таким образом, согласно предлагаемому способу, проведено определение концентрации белка в лизате суспензии клеток. Время проведения анализа 25 мин. П р и и е р 3. Определение концентрации белка в суспензии клеток.Условия выполнения процедуры определения белка как в примерах 1 и 2, только в качестве детергентов для получения лизата клеток используют 17.- ный цетавлон в присутствии 8 М моче- вины и 10 мМ Фосфатного буфера и для удаления осадков амфифильного соединения применяют этанол в концентрации 307.В результате проведенных исследований показано, что для устранения кислотонерастворимого осадка амфифильного соединения, образующегося после обработки пробы белка ТХУ, применима 307-ная концентрация этанола. Определено, что 100 мкл лизата сус" пензии клеток содержат 24 мкг белка. Таким образом, появляется возможность определить микроколичество белка в лизате клеток асцита Эрлиха, Время проведения анализа 25 мин.1404949 Таблица 3 Время проведенияэксперимента, мин,по способу Операции способа(на 10 проб белка) известный предла- гаемый Т а б л и ц а 2 Нанесение проббелка на фильтры 10 Точность измерения, 7 по отношению 10-30 (4 С) 2 оФиксация ТХУ контролю Окрашивание красителем мывка не связав 15 10 е результатов.на 5031 Занижение результатов на20 Ж2 1 Занижение результатовна 203 аркозилат 10 езоксихолат (ДОХ) Подкисление супе натанта0 Итого: лагаемый способ 0,4-1 Не влияе 25 1, 5-2 Тритон Х ЦетавлонСаркозилат М очевина 4 В табл3 предс времени проведения определению концен гласно известному способам для 10 оГтавлено сравнен эксперимента по трации белка сои предлагаемому разцов белка. Данные, доказывающие положительный эффект предлагаемого способа, сведены в табл, 2 и 3, В табп. 2 представлены результаты характеризующие влиУ 5 яние детергентов на точность определения концентрации белка. Амфифильные соеди- Коннения в образцах центбелка рацияж,Известный способ Тритон Х1 Не влияе Додецилсульфатнатрия 1 Занижени Как видно из табл. 2, в предлагаемом способе детергенты не влияют на точность определения концентрации белка, т.е. сравнение контрольных проб (не содержат амфифильных соединений) с пробами, содержащими амфифильные соединения, дает идентичные результаты,шегося красителяобщаяиндивидуальнаяВырезание окрашенного пятнаяЭлюция окрашенногкомплексаЦентрифугирование(уравновешивание,центрифугированиеи т,д.) и м е ч а н и е. (-) - операцияотсутствует,Как следует из табл. 3, в предлагаемом способе процедура определения белка сокращается в 3-4 раза по сравнению с известным.Формула изобретения,Способ определения микроколичеств белка в растворах, содержащих детергенты, включающий кислотйую денатурацию белка, нанесение его на фильтр, окрашивание специфическим красителем, элюцию окрашенного комплекса и последующее колориметрирование, о т л и - ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности и сокращения времени проведения анализа, образующийся в кислой среде осадок детергентов растворяют этанолом в концентрации 25303.