Штамм еsснеriснiа coli в834 (, ), несущий плазмиду rsf 2124, -тест субстрат для рестрикционной эндонуклеазы ecor11

ОП ИСАНИЕИЗОВЕЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз СоветскихСоцнаинстичесинзРеспублик и 908793(51)м, Кл. С 12 й 1/02 ЬеудвретввввнЯ квмктвт СССР ю девам кзабретеккЯ и аткрнткЯОпубликовано 28,02,82, Бюллетень Рй 8 Дата опубликования описания 28,02,82(72) Авторы изобретения В, Г. Косых, Я, И. Бурьянов и А, А, Баев Институт биохимии и физиологии мнкроортатцрмов АНСССР(54) ШТАММ ЕЗСНЕЯЗСН 1 А С 01 В 834 (гвтв ) НЕСУТ)ЙПЛАЗМИДУ ЯЗ Е 2124 - ТЕСТ - СУБСТРАТ ДЛЯ РЕСТРИКЦИОННОЙ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ ЕСО й 11 Изобретение относится к микробиологической промышленности и представляет собойштамм ЕасйенсЬа со 1, несущий плазмиду,используемую как тестсубстрат для определения активности фермента прн выделении иочистке рестрикционной эндонуклеазы ЕсоВ 11, которая используется в молекулярнойбиологии и генной инженерии.Одним из последних достижений молекулярной биологии в последнее время являетсясоздание методов, которые позволяют получатьрекомбинантные ДНК и чйго.Рестрикционные эндонуклеазы стали мощныминструментом при создании рекомбннантныхДНК Ь ч 1 тго а также для излучения первич.ной структуры и физического картироваиияДНК. Поэтому прогресс в молекулярной био.лотки и генной инженерии обусловлен прогрессом в области изучения и выделения ферментов рестрикционных эндоуклеаз,Среди рестрикционных зндонуклеаз, особоеместо занимает рестрикционная эндонуклеазаЕсо Я 11, которая узнает последовательность5 ЦЦ" гг 3 1. 2Однако рестриктаза Есо й 11 - , это мелкощепящая эндонуклеаза, ДНК фага лямбда,она расщепляет боес чем на 35 фрагментов,в то время как другая широко используемаярестриктаза Есо й 1 - на 6 фрагментов.бТаким образом, при вьщеленнн и очисткеЕсо й 11 практически невозможно оценить активность электрофорезом при использованииДНК фага лямбда. Множество фрагментов,1 Ообразующихся при гндролизе ДНК фага лям.бда рестриктазой Есо й 11, не дает яснойкартины о степени гидролиза ДНК.Для определения активности Есо Я 1 требуется ДНК-субстрат с небольшим молеку.1лярным весом, на роль такой ДНК могутподойти ДНК плаэмид,Такими ДНК - субстратами могут бытьДНК амплифицируемых, дающих множествокопий ДНК на клетку, плаэмид, например известная плазмида йв Г 2124, молекулярныйвес 7,4 мегадальтон 2).Однако эти плазмидные ДНК находятся вштаммах Е. со 1 К, которые имеют специфический фермент ДНК - цитознн метилазу. Фермент"Пифко", минимальном агаре Дэвиса с глю.козою и казаминовыми кислотами - колониигладкие, круглыс, прижатые, блестящие, серые, щкрай ровный, мутные (на синтетических средах - более слизистые и мутные). При ростев жидких средах: мясо - псптонный бульон,бульон "Лифко", минимальный М 9 с глюкозойи казаминовыми кислотами образуют ровную, 25интенсивную муть,Физиолого. биохимические признаки штамма.Растет в пределах от 4 до 45 С при оптимумерН от 6,8 до 7,5. В качестве источника углеропа использует многие углеводы, спирты,органическис кислоты, в частности с 1-глюкозу,фруктозу, сахарозу, арабинозу, ксилозу, лак.тозу, трсгапозу. Не усваивает ацстат, аданит,галактозу, в средах с глюкозой активно подкисляст с образованием газа.В качестве источника азота используют как35минимальные соли в аммонийной и нитратнойформс, так в органической форме в виде пептона, аминокислот, Нитраты восстанавливает донитритов.40Желантину не разжижает.Урсазная активность не обнаруживается.Индол не образует,Проявляет устойчивость к антибиотикам -ампициллину (25 мкг/мл).П р и м е р 1. Выледение плазмидной45ДНК,Клетки, содержащие плазмиду, выращиваютв 500 мл бульона до плотности 0,6 (ФЭК,светофильтр Мф 6, кювета 0,5 см). Затемклетки собирают центрифугированием (600020 мин) суспещируют в 4 мл 25%-нойсахарозы в 50 мм трис-НС 1, РН 3,0,добавляюз 1,2 мл лизоцима (1 О мг/мл) иинкубируют И мин во льду при перемешивании,К смеси добавляют 2,4 мл 0.25 М ЭЛТА55(р Н 8,01, оставляют во льду на 10 мин, аэмем попзяляюг последовательно 2,6 мл 5 МРастдора ЧаС и 1,2 чл А-ного расгвора д,деления и оценки активности фермента не только очищенного, но и в грубых экстрактах,3 9 Гметилируез интони в ДНК и аким образомпсласт ДНК илазмип устойчивым к действиюрестрикционной знпонуклсазы Есо В 11 3.Поэтому ила.миды, находящиеся в этихштаммах, не могу служить субстратом для.;со В И. Для этих целей пригодны ДНК,если они вьщелсны из штамма, не содержаще.го ЛНК. цитозинмстилазу,1 рсплагасмый штамм характеризуется следующими признаками.Морфологические признаки, Клетки прямыеиалочковипной формы, 1,1 - 1,5 х 2,0 - 6,0 мк,попвижныс с псритрихиальными жгутиками,допецнлсульфата нагрия, иикубируюг во льду в течение 5-7 ч. Осветлснные лизаты получают центрифугированием смеси при 16000 и в тече. ние 1 ч. К экстрактам добавляют СвС 1 израсчета 0,94 г на 1 мл и бромид этидия до ко.нечной концентрации 200 мкг/мл. Полученнуюсмесь центрифугируют при 44000 об/мин втечение 40 ч в роторе Т 50, Нижнюю, прокра.шенную бромистым зтидием зону, собирают покаплям, прокалывая пробирку поп зоной. Бромид этилия удаляют 2-х кратной экстракциейизопропиловым спиртом. Полученную ДНКпиализуют против 10 мМ трис НС 1, рН 7,5,20 мМ чаС 1, 1 мМ ЭДТА.П р и м е р 2. Трансформация плазмид.ной ДНК.В 100 мл бульона вносят 1 мл культурыЕ, со 1 В 834 и выращивают по плотности0,4, После охлаждения клеток собирают центрифугированием и ресуспендируют в равномобъеме 1 О мл яаС 1. После 20 мин инкубацииво льду клетки собирают цснтрифугированиеми ресуспендируют в 1/2 объеме 75 мМ СаС 1.Клетки инкубируют 20 мин и вновь собираютцентрифугированием, Осадок рсс успсндируютв 1 мл 75 мМ Са С 1,. К О 2 мл суспензииполученных клеток добавляют 0,1 мл ДНКплазмиды 85 Р 2124, инкубируют во льду20 мин. Затем смесь подвергают 2 мин обра.боткс при 42 С и выдерживают 15 мин при24 С. Смесь разбавляют в 1 О раз бульоном,подращивают клетки 30 мин при 37 С и от.бирают но 0,1 мл суспензии, затем высеваютна чашки с питательным агаром, содержащим25 мкг/мл ампициллина,П р и м е р 3, Определение активностирестрикционной эндонуклеазы Есо В 11.К 1 мкг ДНК в буфере, содержащем50 мМ трис -НС 1, РН 7,5, 10 мМ МцС 1, 10 мМ2-мсркаптоэтанола, 1 мМ ЭДТА, добавляют5 мкл эндонуклеазы Есо Я 11, общий объемсмеси составляет 40 мкл. Гидролиз ведут при37 С в течение 15 мин. Полученные фрагментыДНК анализируют с помощью электрофорезав 1%-ном агарозном пластинчатом геле в трис.ацетатном буфере, рН 8,0.Предалагемый штамм, несущий плазмиду,которая может быть использована в качестветест-субстрата для рестрикционной эндонуклеазы Есо В 11, обеспечивает воэможность опреФормула изобретения Штамм ЕасзегсЬа со 1 В 834 (г, пз)несуший плазмиду ЯЯ Е 2124 ест.субстрат длярестрикционной знпонуклеазы Есо Й 11.908793 Составитель М, МирзаевТехред Э.Фсчо Корректор Г. Огар елак гор Е. Дичинская Подписное Заказ 749/27 Тираж 505 ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 13035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5Филиал ППП "Патент",.г. Ужтород, ул, Проектная, 4 5 Хранится во Всесоюзной коллегии микро. организмов при Институте биохимии и физио. логии микроорганизмов АН СССР под номером ВКМВ - 1442 Д,Источники информации,принятые во внимание прн экспертизе