Способ получения -рибулозо-1, 5-дифосфата

(1 ц 89118 Союз Советских Социалистических Республик(22) Заявлено 27.06,78 (21) 2633924/23-04 М. К.з С 07 Н 1104 А 61 К 31/00 с присоединением заявкисударстоенный иомите 23) Приоритет43) Опубликовано 07.04.81. Бюллетень1345) Дата опубликования описания 07,04.81 3) УДК 547.917,0:577,154 (088,8) елам изобретении н открытии 54) СПОСОБ ПОЛУЧЕН Изобретение относится к усовершенствованному способу получения Р-рибулозо,5- дифосфата, который может быть использован в биологии в исследовании процессов фотосинтеза и фотодыхания. 5Известен способ получения Р-рибулозо,5-дифосфата из рибозо-фосфата и аденозинтрифосфата в присутствии ионов Мд+ и трис-буфера с использованием неочищенного бесклеточного экстракта из тионие вых бактерий ТЬ 1 оЬаст 11 цз 58 К в атмосфере инертного газа при комнатной температуре с последующим выделением целевого продукта добавлением к ферментной системе, охлажденной до 4 С, трихлоруксуснойкис лоты, удалением образовавшегося осадка, обработкой полученного раствора активированным углем и прибавлением к очищенному раствору уксуснокислого бария и этилового спирта до конечной концентрации 20 30 об. %. Выход целевого продукта 25% 1.Недостатками известного способа являются низкий выход целевого продукта (25% ), необходимость проведения процесса в атмосфере инертного газа, трудоем кость получения биокатализатора - бесклеточного экстракта из тиониевых бактерий ТЫоЬас 111 из 58 К (требуется фильтрование и сепарирование больших объемов культуры). 30 Р ИБУЛО 30-1,5-ДИфОСфАТА Целью изобретения является упрощение процесса и увеличение выхода целевого продукта.Цель достигается использованием в качестве биокатализатора ферментного препарата из листьев бобов, полученного из водного экстракта гомогената листьев путем осаждения при 50%-ном насыщении сульфатом аммония с последующим обессоливанием на колонке с сефадексом, проведением процесса на воздухе при 35 - 38 С и осаждением целевого продукта после отделения из раствора активированного угля и добавлением уксуснокислого бария, этилового спирта до конечной концентрации его 50 - 60 об, %.Способ получения Р-рибулозо,5-дифосфата согласно изобретению заключается во взаимодействии рибозо-фосфата с аденозинтрифосфатом (АТФ) в присутствии ионов Мд+2 и трис-буфера с использованием ферментного препарата из листьев бобов %с 1 а РаЬа 1, полученного из водного экстракта гомогената листьев путем осаждения при 50%-ном насыщении сульфатом аммония с последующим обессоливанием на колонках с сефадексом, процесс проводят на воздухе при 35 - 38 С, и в последующем выделении целевого продукта путем добавления к ферментной системе,5 10 б 0 б 5 охлажденной до 4 - 5 С, трихлоруксусной кислоты, удалением образовавшегося осадка, обработки раствора активированным углем и прибавлением к очищенному от активированного угля раствору этилового спирта до конечной концентрации его в растворе 50 - 60 об. /о. Выход целевого продукта 1000 мг. Далее бариевую соль Е)-рибулозо,5-днфосфата переводят в натриевую соль действием сульфата натрия. Выход натриевой соли рибулозо,5- диофосфата 600 мг. Пример. 100 - 300 г свежесобранных листьев бобов разрушают в гомогенизаторе типа РТ- в 100 - 300 мл 50 мМ трис-НС 1 буфера рН 8,0, содержащего 10 мМ хлористого магния, 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и 1 мМ дитиотреитола (ДТТ) или Р-меркаптоэтанола, Массу фильтруют через капроновую или нейлоновую ткань. Фильтр ат центрифугируют при 23000 д в течение 30 - 40 мин. Для очистки биокатализаторов к супернатанту добавляют сухой сульфат аммония до 50/О-ного насыщения (0,353 г соли к 1 мл супернатанта), Через 30 мин осадок белка отделяют центрифугированием при 10000 д в течение 10 мин и растворяют в 10 - 30 мл 25 мМ трис-НС 1 буфера рН 8,0, содержащего 0,5 мМ ЭДТА. Раствор белка еще раз центрифугируют при 10000 д 10 мин для удаления нерастворившихся частиц и обессоливают на колонке с сефадексом 6-25 размером 2 см)(30 см, уравновешенной тем же буфером. Элюат начинают собирать при появлении в нем светло-коричневой окраски. Собирают 10 - 30 мл элюата соответственно нанесенному на колонку количеству раствора, Этот элюат или непосредственно супернатант 23000 д добавляют в качестве биокатализатора в инкубационную смесь. Для составления инкубационной смеси (конечный объем 60 мл) готовят следующие растворы: 2 ммоля (навеска 190 мг безводной соли) МЫС 2 растворяют в 5 мл перегнанной из стекла воды, затем в этом растворе растворяют 0,5 ммоля (навеска 77 мг) дитиотреитола. Оптимальной концентрацией АТФ и рибозо-фосфата при проведении реакции является 33 мМ, поэтому на 60 мл инкубационной смеси берут 2 ммоля рибозо-фосфата и 2 ммоля АТФ,2 ммоля рибозо-фосфата бария (навеска 840 мг с учетом содержания в препарате 15% гигроскопической воды) растворяют в 10 мл охлажденной до 0 С 0,1 н, соляной кислоты и добавляют 2 ммоля (284 мг безводной соли) сульфата натрия, осадок Ва 04 удаляют центрифугированием.2 ммоля АТФ, натриевая соль (навеска 1102 мг растворяется в 10 мл перегнанной из стекла воды,15 20 20 З 0 35 40 45 50 55 4Для приготовления инкубационной смеси к 5 мл раствора, содержащего МЫС и дитиотреитол, прибавляют 10 мл раствора рибозо-фосфата и 10 мл раствора АТФ, доводят рН смеси до 7,5 - 7,8 сухим трисбуфером, прибавляют биокатализатор: 10 - 30 мл элюата, собранного с колонки с сефадексом 6-25 (50 - 100 мг белка) или 20 - 35 мл супернатанта 23000 д (100 - 200 мг белка) и доводят общий объем смеси до 60 мл 50 мМ трис-НС 1 буфером рН 7,5 - 7,8. Инкубацию проводят при 35 - 38 С 30 мин, значительного изменения рН не наблюдается, Затем ферментную смесь охлаждают до 4 С, прибавляют 5 мл 50 о - ной трихлоруксусной кислоты и осадок белка удаляют центрифугированием при 1000 д 10 мин. Для очистки В-рибулозо,5- дифосфата к супернатанту добавляют 30 г активированного угля марки БАУ, предварительно промытого 1 н, НС 1, затем 10 О/оной трихлоруксусной кислотой и водой до нейтральной реакции. Уголь отделяют на воронке Бюхнера с отсасыванием и промывают его 4 - 5 раз водой по 100 мл. Опытный раствор и промывные воды объединяют, нейтрализуют до рН 6,0 бикарбонатом натрия и осаждают бариевую соль Э-рибулозо,5-дифосфата прибавлением равного объема 96 о -ного танола, охлажденного до 4 С, и 4 мл 1 М уксуснокислого бария. Через 1 ч стояния при 4 С осадок отделяют центрифугированием при 1000 д 10 мин. Выход бариевой соли 1000 мг СН 80 иРВа 2 мол. вес, 580. Далее растворяют в 17 - 20 мл 0,02 н. НС 1 (в минимальном объеме) и прибавляют 4 ммоля (568 мг безводной соли) сульфата натрия. Осадок сульфата бария удаляют центрифугированием при 1000 д 10 мин, а супернатант нейтрализуют бикарбонатом натрия до рН 6,0, добавляют к нему 96 О/о-ныйэтиловый спирт до 80 об. % и раствор лиофилизируют, Выход лиофилизированного препарата натриевой соли Р-рибулозо,5-дифосфата СзН 80 нР 2 Ка 4, мол. вес. 398 - 600 мг, что соответствует 75% от теоретического.Для проверки способности Э-рибулозо,5-дифосфата акцептировать углекислоту использовали ферментную смесь, содержащую 10 мМ хлористого магния, 10 мМ ДДТ, 40 мМ меченого по углероду бикарбоната натрия (ХаН 4 СО,), 0,44 мкМ рибулозодифосфаткарбоксилазы из бобов (0,2 мг белка на 1 мл ферментной смеси). Данные по выходу, содержанию фосфора и ферментной активности (по количеству акцентированной за 1 мин меченой 4 С углекислоты) приведены ниже. В контроле (без рибулозодифосфата) радиоактивность 100 имп/мин,Заказ 736/12 Изд.288 Тираж 419 Подписное НПО Поиск Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Типография, пр, Сапунова, 2 Выход препарата, мг (М оттеоретического)Содержание фосфора: Р-Рибулозо.105-дифосфата(щелочелабильный) МинеральныйНеизвестныйРадиоактивность, имп/мн,при концентрации Р-рибулозо,5-дифосфата, мМ;0,51,01,52,03,04,0 15Хроматография полученного препарата на бумаге в системе растворителей и-бутанол, уксусная кислота, вода 74; 19: 50 показала незначительное содержание неорганического фосфора. 20Производство Р-рибулозо,5-дифосфата по предлагаемому способу обеспечивает низкую себестоимость препарата: себестоимость 600 мг препарата равна 22 руб.58 коп., 100 мг - 3 руб, 77 коп. 25Формула изобретенияСпособ получения Р-рибулозо,5-дифосфата из рнбозо-фосфата и аденозинтрифосфата в присутствии ионов Миф+ и трисбуфера с использованием биокатализатора с последующим выделением целевого продукта путем добавления к ферментной системе, охлажденной до 4 - 5 С, трихлоруксусной кислоты, удаления образовавшегося осадка, обработки раствора активированным углем и прибавления к очищенному от активированного угля раствору уксуснокислого бария и этилового спирта, отл ич а- ющ й с я тем, что, с целью упрощения процесса и увеличения выхода целевого продукта, в качестве биокатализатора используют ферментный препарат из листьев бобов Ис 1 а РаЬа 1,., полученный из водного экстракта гомогената листьев путем осаждения при 50%-ном насыщении сульфатом аммония с последующим обессоливанием на колонках с сефадексом и процесс проводят на воздухе при 35 - 38 С, а этиловый спирт добавляют до конечной концентрации его в растворе 50 - 60 об. %. Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Авторское свидетельство СССР Юв 309610, кл, С 12 Р 13/10, заявлено 28,11.69 (прототип).