Способ получения пептидов

О и и с,А:.",ЮЗБ) ИЗОВРЕТЕН ИЯ454236 Союз Советскив Социалистических РеспубликК ПАТЕНТУ 1 Зависимый от патента 1) М. Кл. С 07 с 10352 влено 24.09.71 (21) 1700240,23(33) ФРГОпубликовано 25.12,74. Бюллетень .Хо 4Дата опубликования описания 27.02.75 Гасударственный комите Совета Министров ССС 3) УДК 547.964,4,07(72) Авторы изобретения Иностранцы Дитер Гиллессен71) Заявитель 54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИД Изобретение относится к получению пептидов на полимерных носителях в гомогенной фазе.Известный способ получения пептидов на полимерном носителе в органическом растворителе состоит в том, что 1 х 1-защищенную аминокислоту в виде соли конденсируют при нагревании в органическом растворителе с хлорметилированным полистиролом. 1 х 1-защиту удаляют известными методами и необходимую аминокислотную последовательность создают конденсацией полимер - аминокислоты с соответствующими К-защищенными аминокислотами в растворе. После каждой стадии полимер - пептид отделяют от низкомолекулярных веществ осаждением. После постройки аминокислотной последовательности пептид отделяют от полимера, Применение известного способа связано с некоторыми трудностями. Вопервых, присоединение первой аминокислоты к полимеру требует относительно жестких условий реакции (нагревание в присутствии триэтиламина). Во-вторых, осаждение полимерпептида после каждой стадии происходит не полностью, вызывает его фракционирование и увлечение в осадок низкомолекулярных примесей. Это приводит к потерям целевого пептида и его загрязнению.Предлагаемый способ получения позволяетизбежать указанных трудностей, К-защищенную С-концевую аминокислоту создаваемого пептида связывают в мягких условиях в растворе сложноэфнрной связью с гидроксилсодержащим полимером - носителем с мол. в. а 10 000 - 100 000. В качестве полимера - носителя могут быть использованы полиэтиленгликоли, их сложные эфиры с лимонной кислотой, сополимеры полиэтиленгликоля с янтарной кислотой и т. д. Образование сложной эфирной связи можно проводить, например, с помощью дициклогекснлкарбодинмида. Можно также предварительно вводить С-концевую аминокислоту в мономер, а затем получать полимер-носитель с присоединенной О аминокислотой. 1 Х 1-защиту с полимер - аминокислоты удаляют, например, ацидолнзом или гндрированием. Полимер отделяют от низко- молекулярных веществ диализом, ультрафильтрацией, колоночной хроматографией нли про тивоточным распределением, а не осаждением, как в известном способе. Дальнейшее ступенчатое наращивание пептидной цепи ведут как обычно, применяя для образования амидной связи дициклогексилкарбодиимцд, алкцлхлорформцат, азцды плп активпрованные эфиры М-защищенных аминокислот, Реакцию проводят в растворе в органических растворителях. Для водорастворимых полимеров - носителей возможно образование амидной связи в водной среде, В этом случае как конденсирующее средство применяют водорастворимый карбодиимид. После каждой стадии конденсации М-защиту отщепляют подходящим способом и полимер отделяют от низкомолекулярных веществ. Разрушение связи готового пептида с полимером-носителем проводят известными методами, например щелочным гидролцзом или аммонолизом. Пептид отделяют от полимера одним из указанных методов,П р и м е р 1, Этерификация БОКф-валил-ОН с ПЭТ (мол. в. 20000).20 г ПЭГ 4,34 г БОК-валил-ОН и 4,12 г ДЦК растворяют в 200 мл СН,С 1, и перемешивают при комнатной температуре без доступа влаги в течение 5,5 суток. Реакционную смесь выпаривают в вакууме досуха, прибавляют 100 мл 4 н, НС 1/диоксана, перемешивают при комнатной температуре в течение 30 мин и выпаривают досуха в вакууме. Остаток растворяют примерно в 1 л воды. Образующийся при этом осадок выделяют при помощи фильтровального вспомогательного вещества. Фильтрат доводят до рН 6 при помощи ИаОН или триэтиламина и ультрафпльтруют через Диафло ультрафильтр УМ 10 пока в фильтрате можно обнаружить свободный валин. Фильтрат выпаривают в вакууме досуха, остаток высушивают смесью бензола с абсолютным этанолом (80/20)до постоянного веса. Выход Н-валил-ПЭГ 19,35 г, Содержание аминокислоты 80%, или 0,08 ммоль/г (аминокислотный анализ).Б. Синтез пептида. 5 г Н-валил-ПЭГ растворяют в 50 мл СНС 1, и прибавляют 0,1 мл триэтиламина, После прибавления 0,44 г БОК- глицил ОН (2 5 ммоля) и 0 515 г ДЦК (2,5 ммоля) перемешивают 2 часа при комнатной температуре, выпаривают досуха в вакууме, в течение 30 мин обрабатывают прц комнатной температуре 40 мл 4 н. НС 1/дцоксана и снова выпаривают досуха в вакууме, Маслянистый остаток растворяют в 500 - 700 мл воды, осадок отделяют, фильтрат доводят до рН 6 при помощи МаОН илц трцэтиламцна и подвергают ультрафильтрацпц через Дпафло ультрафильтр УМ 2. Фильтрат обрабатывают. Выход Н-глицил-валпл-ПЭГ 4,85 г.Указанным образом к Н-глицил-валил-ПЭГ прибавляют триэтплампн и приводят в реакцию с 2,5 мм БОК-аланцл-ОН и 2,5 ммоль ф БОК - трет-бутоксикарбонилффПЭГ - полиэтиленгликольфффДЦК - лициклогексилкарбодиимид 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 ДЦК. После отщепления защитной группы и ультрафильтрации получают 4,75 г Н-аланилглцццл-валил-ПЭГ, Соответствующим взаимодействием Н-аланил-глицил-валил-ПЭГ с БОК-лейццл-ОН и ДЦК получают Н-лейцилаланил-глиццл-валцл-ПЭГ (4,5 г). Аминокислотный анализ гидролизованной пробы этого вещества показывает следующее соотношение аминокислот: валил: глицил: аланил: лейццл =1,08: 1,00: 0,90: 1,04.В. Отщепление тетрапептида от носителя. Раствор 4,0 г Н-лейцил-аланил-глицил-валил- ПЭГ в 75 м воды и 1,5 мл 1 н. КОН перемешивают в течение 2 час при комнатной температуре, точно нейтрализуют 1,5 мл 1 н. НС 1 и ультрафильтруют через Диафло ультрафильтр УМ 10 до тех пор, пока не будет собрано 3,5 л фильтрата. Он дает после выпаривания в вакууме 280 мг сырого продукта, который частично освобождают от ХаС 1 дигерированием абсолютным метанолом. Метанольный раствор обеспечивают углем, фильтруют и выпаривают досуха. Остаток растворяют в воде и лиофнлцзуют. Получают 191,5 мг сырого тетрапецтида, амцнокислотный анализ которого показывает следующее соотношение аминокислот: валил: глицил: аланил: лейцил=1,03: : 1,00: 0,85: 1,07. Доля пептида в сыром веществе составляет 35% (аминокислотный анализ), т. е, рассчитанный на первую аминокислоту (валин) общий выход составляет 45% Вещество идентично заведомому образцу, полученному по методу Меррифилда.Пр имер 2.А, К 4,34 г БОК-валил-ОН и 2,8 мл триэтиламина в 80 мл СНС 1, прикапывают при перемешиванци при - 5 С 1,91 мл этилового эфира хлоругольной кислоты в 20 мл СНС 1, через 30 мцн при - 5 С прибавляют охлажденный ( - 5 С) раствор 20 г ПЭГ (мол. в.20000) и 2,4 г (20 ммоль) диметиламинопиридина в 100 мл СНС 1. Реакционную смесь перемешивают в течение часа при - 5 С и 65 час прц комнатной температуре. Для блокировки не прореагировавших гидроксильных групп перемешивают реакционную смесь 4 часа с 10 ммолями уксусного ангидрида и 10 ммоль триэтцламина при комнатной температуре и вьшаривают в вакууме досуха. Остаток обрабатывают 30 мин при комнатной температуре 00 мл 4 н. НС 1 в диоксане, выпаривают досуха в вакууме и растворяют примерно в 1 л воды. После фильтрации и установки рН ультрафпльтруют и обрабатывают как описано выше. Выход 19 г Н-валил-ПЭГ. Содержание аминокислоты 60%, или 0,06 ммоль/г (аминокислотный анализ).Б. Исходя из 12,7 г Н-валил-ПЭГ, синтезируют описанный в примере 1 Б тетрапептид тем же образом. Реагенты: 1 ммоль триэтиламина, 4,0 ммоля БОК-аминокислоты, 4,0 ммоля ДЦК, Получают 11,5 г Н-лейцил-аланилглицил-валил-ПЭГ со следующим соотношением аминокислот: валил: глицил: аланил: лейцил =-0,88: 0,86: 1,11: 1,00, 454736В. Как описано в примере 1 В, гидролизуют 10 г Н-лейцил-аланил-глицил-валил-ПЭГ в 100 мл воды и 3 мл 1 н, КОН. После нейтрализации, ультрафильтрации и обработки пол- чают 300 мг сырого тетрапептида, который имеет следующее соотношение аминокислот: валил: глицил : аланил : лейцил=0,96: 0,91: :1,24: 1,00. Для пептида в сыром продукте составляет 41 % (аминокислотный анализ), т. е., считая на первую аминокислоту (валил), общий выход составляет 57% от теопетпческого.П р и м е р 3. К 6 г Н-валил-ПЭГ (80%, 0 5 ммоля валина и 0,09 мл тпиэтиламттна (0,6 ммоля), раствовенньтм в 600 мл СН.С 1, прибавляют 1,05 г БОК-глицил-ОНФ (3.5 ммоля) и перемешивают 24 часа при комнатной температуре, После выпаривания в вакууме остаток перемешивают 30 мин при комнатной температуре с 60 мл трифторуксусной кислотьт/СН.С 1, (1:1) и вновь выпаривают досуха в вакууме. Остаток растворяют примеоно в 700 мл воды, фильтруют и фильтрат доводят до рН б при помощи КаОН.После ультрафильтрации (диафло ультра- фильтр УМ 10) обрабатывают как описано в примере 1 Б. Выход Н-глицил-валил-ПЭГ 5,88 г.Аналогично примеру 1 Б Н-глицпл-валпл- ПЭГ обрабатывают БОК-лейцил-ОНП. Получают 5,6 г Н-лейцил-аланил-глпцил-валттл- ПЭГ со следующим соотношением аминокислот: валил: глицил: аланил: лейцил= 1,00: : 0,70: 0,78: 0,71. 5,6 г Н-лейцпл-алянпл-глпцил-валил-ПЭГ гидролизуют по пртттттерс 1 В п отщепленный тетрапептид обрабатывают соответственно, Получают 250 мг сырого тетрапептида со следующим соотнотпенпем аминокислот: валил: глицпл: аланил: лейцпл= 1,00: : 0,83: 0,93: 0,88. Доля пептида в сттгтот тетрапептиде составляет 32%, т. е., считая ня первую аминокислоту (валин), обтттттй выход составляет 50% от теоретического.Пример 4,А. 10 г ПЭГ (мол. в. 20000), 1,75 г БОК- глицил-ОН и 2,06 г ДЦК растворятот в 100 хтл СНС 1 и перемешивают в течение 6 суток прп комнатной температуре. Реакционную смесь выпаривают в вакууме досуха, попбавляют 100 мл 1,2 н. НС 1 в ледяной уксуснои кислоте и переметцивают 20 мин при котнатной темгтер атуре.Растворитель отгоняют в вакууме, а к остатку прибавляют 100 мл воды. Полученныч осадок отделяют центрифугированием, Прозпачньтй верхний слой декантируют, доводят до пН б триэтиламином и ультрафильтрутот через Диафло ультрафильтр УМ 10 до тех пор, пока чльтрафильтрат еще содержит глицил-ОН. Остаток выпаривают в вакууме и следы воды дважды азеотропно отгоняют с бензолом. Продукт сушат в экссикатопе до постоянного веса. Выход Н-глицил-ПЭГ 9,8 г, содержание амттнокислоты 0,06 ммоль(г.Б. 9,8 г Н-глицил-ПЭГ растворяют в 60 м.ч СНС 1, и нейтрализуют 0,7 ммоля И-метттл.морфолпна. В отдельном сосуде раствопятот 3 ммоля БОК-лейцпл-ОН в 5 мл СН.С 1 и 1 тл дттатетттлс 1 тормяхтттда, нейтпалттзуют 3 ммоля Х-метттлхтогт 11 олт.на, охлаждают до - 20 С, прибавляют 2,6 ммоля ттзобутттлхлопофортттата и перемешивают 10 мпн прп - 20, Смешанныи ангидрид ппибавляют при - 20 С к раствору Н-глттцпл-ПЭГ и переметтптвяют в течение часа прп - 20 п 2 часа прп 4 С, Растворптель отгоняют, остаток обрабатывают 15 мпн ппп комнатнотт тнмпературе 50 мл 1,2 н. НС в ледяной уксусной кислоте и опять выпариватот в ватсглте досуха. Остаток паствопяют в 100 мл воды, доводят до пН 6 водньтм паствором апетата натппя и тльтгтят 1 тттльтруют через Диафло ультрафильтр УМ 10. Остаток выпаппвают в вакууате досуха, дважды азеотрогно вьтсчттттвятот с бензолом и сутпат в эксспкаторе. Выход Н-лейцил-глттцпл- ПЭГ 9.5 г.Аналогично сочетают другие амттнокттслоты в вттде следтотттттх ттпоттзводньтх: БОК-алянттл- ОН, БОК- (О-бензпл) -тпеонил-ОН, БОК-лейцпл-ОН, БОК-валттл-ОН, БОК (О-бензтт т) -тпеонпл-ОН, БОК-валил-ОН. После последнего сочетания полчают 8,0 г. Н-вялттл-треонпл - валил - лсйцпл - тпеонилбснзпл бензпл аланттл-лет"тцттл-глт.ттттл-О-ПЭГ Аналттз ампнокттслот гттдролизттпованной пробы этого вещества дал следующий результат.глттцпл : лейцпл ; аланил : треонил : валил= 1,0: 1,89: 1,67: 1,0. Значения для отдельных амттнокислот получили пз результатов анализов аминокислот на промежуточных ступенях.Пример 5.А, Лютонную кттслотч этерифицируют в сложный эфттр с ПЭГе (мол. в. 6000 т с помотцью этсвттмо,тяпного количества ДЦК Ьассчтттано на ПЭГ) в метпленхлопиде (10%-ный раствор) в течение 3 суток. Раствортттель отгоняют, остаток растворяют в воче тт полученньпт осадок отттентрттфугттгтттот. Раствор ультрафи,тьтпутот (Ааттткон, УМ-фильтр) упаривают г. вяюуме и остаток сутпат до постоянного веня. Выход 80% от теопетттческого. Высушенный полтптер этерпфпцттруют БОК-валил-ОН и ДЦК (обя компонента в 5-кратном избытке, считая ня 0,2 ммоль(г функциональ ных грпп ня полтвтегте 1 в 10%-ном растворе в СНзС 1. в течентте 3 суток при комнатной темперят ре. Содержание яатттнокттслотьт в полимере после принятой обработки тт отщепления БОК-группы с 4 н. НС 1 диоксан; : 0.2 атхтоль/г.Б. По ДЦК-методу пол чают следующие актттв 1 тровянньте с,тожные эфиры: 35 40 45 50 55 60 5 10 15 20 25 ф) З.кратный избыток ПчГ, считая на функциональные группы лимонной кислотыБОК-глицил-ОНФ,ф) 01.1 Ф - е-нитрофенпл БОК-лейцил-ПХФ ",БОК-глутаминил-ОНФ.Сочетания проводят следующим образом.1 ммоль (5 г) Н-валил-полимера растворяют в 50 мл СНС 1/диметилформамид (1; 1), нейтрализуют 1,2 ммоля М-метил-морфолина ц прибавляют 3 ммоля активированного эфира БОК-аминокислоты. Через 5 мин к раствору прибавляют еще 1,2 ммоля Х-метил-морфолина и перемешивают 2 часа при комнатной температуре. Растворитель отгоняют в вакууме, к остатку прибавляют 50 мл 4 н. 1-1 С/диоксана и оставляют стоять на 30 мин при комнатной температуре. После повторной отгонки растворителя растворяют остаток в смеси воды/этанола (3: 1) и ультрафильтруют при помощи Диафло ультрафильтра УМ, Остаток сушат. Выход Н-глицил-лейцил-валил-полимера 4 г. Результат аминокислотного аналпза гидролизованной пробы: валил; лейцил: глицил: глутаминил=1,0: 0,9: 1,0: 0,98.2,0 г Н-глутаминил-глицил-лейцил-валил-полимера перемешивают 4 час в 0,2 н, КОН (50 мл) при комнатной температуре, нейтрализуют 2 н. НС 1 и пропускают через колонну (2,5;к,100 см) с Сефадексом 6-25. Сырой пептид Н - глутамицил - глицил - лейцил - валил- ОН получают с выходом примерно 50%. Аминокислотный анализ дает следующие значения; валил: лейцил: глицил: глутаминил=1,0: 0,88: 1,05: 0,98.Пример 6.А. ПЭГ (мол. в. 4 000) этерифцццруют 10- кратным избытком БОК-глицил-ОН ц ДЦК в 10%-ном растворе СН,С 1 в течение 5 суток при комнатной температуре. После этого отщепляют защитную группу, растворитель отгоняют, остаток растворяют в воде и полученный осадок отделяют центрифугированием. Раствор ультрафильтруют с Диафло ультра- фильтром УМ, растворитель отгоняют ц остаток сушат. Содержание аминокислоты найдено аминокислотным анализом как 100%-ное.Малеиновую кислоту подвергают взаимодействию с и-нитрофенолом и ДЦК, получая ди- ОНФ-эфир малеиновой кислоты. Выход примерно 80% от теоретического, температура плавления 185 в 1 С. На двойную связь полученного таким образом сложного эфира малеиновой кислоты присоединяют йодоводород. Полученный ди-и-нитрофениловый эфир монойодянтарной кислоты подвергают взаимодействию с Ад-солью БОК-валил-ОН, получая ди-ОНФ-эфир БОК-валил-О-янтарной кислоты,Эквимолярные количества ПЭГ-глицил-Н (нейтрализованный И-метил-мор фоли ном) ц ди-ОНФ-эфира БОК-валил-О-янтарной кислоты растворяют в СНС диметилформамцдс (1: 1; 10-ный раствор) и перемешивают црц комнатной температуре 24 часа, После этого отгоняют растворитель, остаток растворяют в воде и ультрафильтруют (Диафло ультраф х( . пгцтлхл 01 февил 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 фильтр УМ), пока толидиновая проба в ультрафильтрате не станет отрицательной. Фильтрат упаривают в вакууме и остаток сушат. Аминогруппы Н-глицил-ПЭГ после этого подвергают взаимодействию с ангидридом 3. сульфопропионовой кислоты. Из полученного продукта отщепляют БОК-групцу црц помощи 4 н. НС 1/диоксана. Полученный полимер цмсет мол. в, выше 20000 (согласно удержаншо),Б. 2 г полученного полимера ц 6 ммолей БОК-лейцил-ПХФ перемешивают ь 20 мл СНС 1 г/диметилформамида (1: 1) 3 час црц комнатной температуре (через 5 мцн прибавляют к реакционной смеси 2 ммоля Х-метилморфолина), После этого отгоняют раствори- тель в вакууме, остаток обрабатывают 20 мин 40 мл 4 н, НС 1/диоксана и растворитель опять отгоняют, Остаток растворяют в 100 мл воды ц чльтрафильтруют (УМ), Воду выпаривают и остаток сушат.Выход 1,9 г. Анализ: валил: лейцил=1,0: : 0,95,В, 1,9 г дипептид-полцмера перемешивают в течение 3 час при комнатной температуре в 0,2 н. водного КОН, нейтрализуют 2 н. НС ц ультрафильтруют через УМ-фильтр. Филь- трат выпаривают в вакууме, Выход сырого продукта 350 мг. Содержанце цецтцда составляет 70%. Аминокислотный анализ: валил; : лейцил = 1,0: 0,97.П р и м е р 7. Сначала этерифицируют БОК- глццил-ОН с ПЭГ (мол. в. 200) согласно примеру бА. Удаление изоыточных компонентов проводят ультрафцльтрацией с Диафло фильтром УМили хроматографией на Сефадексе. Полученный продукт конденсируют аналогично примеру б с ди-ОНФ о-эфиром малец- новой кислоты. К продукту конденсации присоединяют йодоводород и йодированный продукт подвергают взаимодействию с Ао-солью БОК-аланил-ОН.В качестве растворителя применяют вместо эфира диоксан. После этерификации раствори- тель отгоняют, остаток растворяют в воде ц ультрафцльтруют (УМ-фильтр). После сушки остатка получают 95% этерифицированного полимера.После отщепленця защитной группы сочетают с БОК-лейнил-ПХФ.Выход дццептцдцолимера 1,95 г (93% от теоретического).Амцнокцслотный анализ: алании: лейцил= 1,0: 1,01. Отщепление пептида от цолцмерного носителя дает 300 мг сырого продукта.Выход;ю данным аминокислотного анализа 80% от теоретического: аланцл: лейццл = 1,0 :1,0,Пептид однороден при тонкослойной хроматографии в системе ледяная уксусная кислота (бутанол) вода (3: 1: 1).Пример 8.А. 10 г ПЭГ (моль. г. 20000), 1,1 б г БОК- изолейцил-ОН и 1,03 г ДЦК растворяют в):Д - бензилоксикарбонил 100 мл СНС 1, и перемешивают 6 суток прц комнатной температуре без доступа влаги. Реакционную смесь выпаривают досуха в вакууме, прибавляют 50 мл 4 н. НС 1/дцоксана и перемешивают 30 мин при комнатной темпе. ратуре. После отгонки растворителя остаток растворяют в 100 мл воды ц выпавший осадок отделяют центрифугцрованцем. Отдекантцрованный раствор доводят до рН 6 цри помощи 2 н. 1 х 1 аОН и ультрафильтруют через Дцафло ультрафильтр УМ. Фцльтрат выпаривают досуха в вакууме и сушат. Выход Н-цзолейцил-ПЭГ 9,8 г. Содержание цзолейцила, согласно амцнокцслотному анализу, 0,07 ммоль /г (70 О/о от теоретического).Б, Полученный продукт сочетают по очереди с БОК производными аланнна, валина и фенилаланцна по следующей схеме. 10%-ный водный раствор полимера доводят до рН 3,9 при помощи 4 н. КаОН илц 5 н. Н,ЯОи охлаждают до 4 С. В отдельном сосуде растворяют БОК-аминокислоту (5-кратный избыток по сравнению с амипокомпонентной) в 2 - 3 мл диметилформамида и прибавляют к водному раствору полимера, поддерживая рН 3,9 постоянным. При тех же рН и температуре при перемешивании прибавляют эквимолярное БОК-аминокислоте количество и-толуолсульфоната Х-циклогексил-Х- р- (Х-метил-морфолино) -этил - карбодиимид-г - толуолсульфонат, поддерживая рН 3,9 при помощи 5 н. Н,504. Примерно через 15 мин, когда рН больше не изменяется, доводят рН до 7,0 прц помощи 4 и. ХаОН и перемешивают 30 мин при комнатной температуре.Затем рН опять доводят до 3,9 н снова прибавляют эквнмолярное количество конденсирующего средства. Раствор оставляют на 3 - 4 часа при рН 7,0 и комнатной температуре и ультрафильтруют. Выпариванием в вакууме получают тетрапептнд-полнмер.В. Тетрапептид-полимер (9 г) обрабатывают 24 час 2 н. КОН в смеси воды/диоксана (9 г в 50 мл) нейтрализуют и подвергают гель-фильтрации через колонну (2,5 М 80 см) с Сефадексом Сгв водном растворе, Воду отгоняют (при 40 С). Остаток растворяют в метаноле, растворитель отгоняют и пептнд сушат. Выход сырого Н-аланил-валил-фенилизолейццл-ОН: примерно 300 мг (не совсем свободен от солей). Амицокислотный анализ дает выход примерно 0,5 ммоля (751 О от теоретического, считая на содержание аминокислоты в полимере).Результат анализа после хроматографии на колонне: изолейцил : фенцл: валил : аланил=1,0: 0,99; 0,90: 0,97.Пример 9.А. 20 г ПЭГ (мол.,в. 20000), 5,0 г Ц"-валип-ОН ц 4,2 г ДЦК растворяют в 200 мл СНС 1, и перемешивают 10 суток прц комнатной температуре без,доступа влажности. К реакционной смеси прибавляют 1,2 мл ле 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ц 5 дяной уксусной кислоты, перемешввают еще 20 час и выпаривают в вакууме досуха. Остаток растворяют в 300 мл МеОН, прибавляют 5 мп 4 н. НС 1/МеОН и гидрируют,над Рй/С при комнатной температуре н нормальном давлении, пока поглощается водород, Катализатор отфильтровывают, фильтрат выпаривают в вакууме досуха, остаток растворяют примерно в 1 л воды и образующийся осадок отделяют. Фцльтрат ультрафипьтруют через Дцафло ультрафильтр УМи его обрабатывают дальше, как описано в примере 1 А. Выход 18,8 г Н-ва,тил-ПЭГ НС 1,Содержание аминокислоты 88 О/ или 0,088 ммоль/г (аминокислотный анализ),Б. 10 г Н-валил-ПЭГ НС 1 растворяют в 50 мл СНС 1, охлаждают,до - 20 и раствор доводят до рН 8 - 9 прибавлением 0,11 мл И-метилморфолина. 1,05 г Ц-,глицил-ОН растворяют в 10 мл тетрапидрофурана, охлаждают до - 20, прибавляют 0,55 мл 1 х 1-метилморфолцна и 0,65 мл изобутилового эфира хлормуравьиной кислоты и перемешивают 5 мин при - 20. Эту смесь прибавляют к охлажденному до - 20 раствору НчвалилПЭГ ц перемешивают 30 мин ниже - 10, 30 мцн ниже 0 ц 3 час при комнатной температуре. Реакционную смесь выпаривают в вакууме досуха, остаток растворяют в 200 мл МеОН, прибавляют 1,25 мл 4 н, НС 1/МеОН и Рс 1/С ц гидрируют,прц комнатной температуре ц нормальном давлении до окончания поглощения,водорода. Катализатор отфильтровывают, фильтрат выпаривают в вакууме досуха, остаток растворяют примерно в 1 л воды, фильтруют и ультрафцльтруют через Дцафло ультрафильтр УМ, Фильтрат от ультрафцльтраццц выпаривают досуха в вакууме, сушат при помощи бензола/абсолютного этанола (80/20) и ночь в экссикаторе до постоянного веса,Выход Н-глицил-валцл-ПЭГ НС 1 8,0 г.Аналогично доводят 4,0,г Н-глццил-валил- ПЭГ НС 1 до рН 8 - 9 при помощи 0,05 мл М-метцлморфолина и подвергают взаимодействию с раствором смешанного ангидрида, изготовленным цз 500 мг Ц-аланцл-ОН, 0,22 мл Х-метцлморфолцна ц 0,26 мл цзобутилового эфира хлормуравьиной кислоты в 5 мл тетрагидрофурана. После отщепленця защитной группы и ультрафильтрациц получают 3,8 г Н-аланцл-глицил-валцл-ПЭГ НС 1. Соответствую ццм взаимодействием этого продукта с Ц-лейццл-ОН, 1 Х 1-метилморфолцном ц изобутцловым эфиром хлормуравьцной кислоты получают после отщепленця защитной группы и ультрафильтрациц 3,5 г Н-лейцил-аланцлглццил-валил-ПЭГ НС 1,Анализ аминокислот гцдролцзцрованной пробы этого вещества показывает следующее соотношение аминокислот; валил: глицил: : аланцл: лейцил= 1,00: 0,89: 0,92: 0 94.В, 3,4 г Н - лейццл - аланцл - глиццл - валцл- ПЭГ НС 1 гцдролцзуют аналогично примеруВ в 62 мл воды прц помощи 1,25 мл 1 н,Я 736 45 50 55 Сос 1 авитель А. Васильев Корректор Т, Хворова Редактор Н. Джараглти Тех реп Т,Миронова Из,т,239 Подписное иии 250/ 5 Тираж 506 Сапунова, 2 Типографи 51, пр. КОН. После нейтрализации, ультрафильтрации и обработки получают 163 мг сырого тетрапептида Н-лейцил-аланил-глицил-валил- ОН, который имеет соотношение аминокислот валил:глицил: аланил: лейцил= 1,00: 0,94: : 0,96: 0,96. Доля пептида в сыром пептидном материале составляет 44 % (аминокислотный анализ), т. е., считая на первую аминокислоту (валин) выход составляет 65%.Пример 10. 4,0 г Н-глицил-валил-ПЭГ НС 1 растворяют в 25 мл СНС 1 ь доводят до рН 8 - 9 при помощи 0,05 мл Х-метилморфолина и прибавляют раствор 700 мг Ц-лейцилаланил-ОН в 3 мл диметилформамида. К реакционной массе прибавляют 230 мг М-оксисукцинимида и 420 мг ДЦК и перемешивают 6 час при комнатной температуре. Смесь выпаривают в вакууме досуха, остаток растворяют в 200 мл МеОН и после прибавления 0,5 мл 4 н. НС 1/МеОН и Рс 1/С гидрируют прп комнатной температуре и нормальном давлении до окончания поглощения водорода. Катализатор отфильтровывают, фильтрат выпаривают в вакууме досуха и остаток растворяют примерно в 1 л воды. Полученный осадок отделяют и фильтрат ультрафильтруют и обрабатывают.Выход Н-лейцил -аланил -глицил -валил- ПЭГ НС 1 3,8 г.3,7 г Н-лейцил-аланил-глицил-валил-ПЭГ НС 1 гидролизуют и обрабатывают аналогично примеру 1 В. Получают 161 мт сырого тетрапептида Н-лейцил-аланил-глицил-валил-ОН с соотношением аминокислот валил: глицил; : аланил: лейцил=1,00: 0,97: 0,86: 0,83. Доля пептида в сыром пептидном материале составляет 45% (аминокислотный анализ), т. е., считая на первую аминокислоту (валин), выход составляет 61%.Пример 11.А. Аналогично примеру 9 А подвергают взаимодействию в течение 13 суток 20 г ПЭГ (мол. в, 20 000) с 5,0 Ц-про-ОН и 4,2 г ДЦК. После отщепления защитной группы и диафильтрации получают 19,3 г 8 нпро-ПЭГ НО. Содержание аминокислоты 50%, пли 0,05 ммоль/г (аминокислотный анализ).Б. 10 г Н-про-ПЭГ НС 1 растворяют в смеси 20 мл СН,С 1 и 40 мл диметилформамида, охлаждают до - 30 и раствор доводят до рН 8 при помощи 0,07 мл триэтиламина.700 мг пироглутамил-гис-ИНа растворяют в смеси 10 мл диметилсульфоксида, 1 О мл диметилформамида и 6,3 мл 2,4 н. НС 1/тетрагидрофурана при 0, охлаждают до - 20, прибавляют 0,5 мл изоамилнитрита, перемешивают в течение 30 мин при - 20 и нейтрализуют прибавлением 2,1 мл триэтиламина. 5 10 15 20 25 30 35 40 Эту смесь прибавляют к также охлажденному до - 30 раствору Нипро-ПЭГ, перемешивают 30 мин ниже 0 и 15 час при 4, выпаривают досуха в вакууме, остаток растворяют примерно в 1 л воды, ультрафильтруют через Диафло ультрафильтр УМи обрабатывают,Выход пироглутамилепро-ПЭГ 9,9 г, Найдено соотношение аминокислот про: : глу=1,00: 0,65. Этот продукт растворяют в 50 мл СН,С 1 и доводят до рН 8 при помощи триэтиламина, снова подвергают той же реакции с 700 мг пироглутамин-гис-К.Оа и обрабатывают как олисано выше.Выход 9,5 г пироглутамин-гис-про-ПЭГ. Этот продукт подсказывает соотношение аминокислот про: глу=1,00: 1,00.В. 5,0 г пироглутамин-гис.про-ПЭГ растворяют в смеси 250 мл МеОН и 25 мл СНаС 2, Раствор при - 5 насыщают сухим ХНз, хранят в течение 36 час при комнатной температуре, еще раз насыщают при - 5, хранят в течение 4 суток прои,комнатной температуре и выпаривают в вакууме досуха, Остаток растворяют в МеОН, выпаривают досуха, растворяют в 750 мл воды и ультрафильтруют через Диафло ультрафильтр УМ. После этого концентрируют раствор сначала до 250 мл и затем диафильтруют с 1,5 л воды. Фильтрат выпаривают в вакууме досуха, остаток растворяют примерно в 20 мл МеОН, обрабатывают углем, фильтруют, выпарива 1 от досуха в вакууме, растворяют в 100 мл воды и лиофилпзируют, Выход сырого пироглутамин-гис-про-МН 210 мг. Соотношение аминокислот в веществе про: гис: глу =1,00: : 0,87: 1,03, Доля пептида в сыром материале составляет 28% (аминокислотный анализ), что соответствует выходу 63%, считая иа первую аминокислоту (пролин) . Предмет изобретения Способ получения пептидов, о т л и ч а ющ и й с я тем, что аминокислоту, которая связана сложноэфирной связью с растворимым в воде и (или) органическом растворителе гидроксилсодержащим полимером с мол. в.10 000 - 100 000, например полиэтилснгл: колем, сочетают в гомогенной фазе известными методами с другими аминокислотами, отделяя полимер - пептид от низкомолекулярных веществ после каждой стадии с помощью диализа, колоночной хроматографии, ультра- фильтрации или противоточного распределения, и после построения необходимой последовательности пептид отделяют от полимера известными способами.