Способ получения 6-аминопенициллановой кислоты

Союз СоветсюаСоцналнстнцесюаРеспублнк ЬГц 6541 7 О А 76 ЙУУ(53) УЙ 547,789. .6.07 (088, 8) ования описания 28.03,7 опу 72) Авторы иаобретен Иностранцы мас Адриан Сэвидж иЛоусо ям Паувепл 1) Заяв) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 6-АМИНОПЕНИЦИЛЛАНОВОЙ КИСЛ бу полупоты тение относится к спос минопеницицнановой ки которая используется основе различных высо тибиотиков, например а ициппина, оксациппина. Изобре чения 6-а (6-АПК) за на ее тивных а коэффек- моксици пина, ам особ получения 6-АПК, эгидропизе при рН 6,0- вора бенэил- или феноксиа нерастворимым в воде плексомт состоящим из Известен спкпючающийся в9,0 водного растмети ппеници плиферментным ком пенициллиновой аципазы, адсорбированнойна нерастворимом в воде полимерном субстрате и поперечно-сшитой с помощью 1 Ьагента образующего поперечные связи ивыбранного иэ группы, включающей альдегид глутаровой кислоты, гпиоксапь илиформальдегид1),Используемый комплексмеханически прочен и достаточно устойчив к действию щелочи; в качестве субстратаиспользуется алифатический диамин идиапьдегид дпя связывания фермента сполимерным носителем. Недостаток комплексов полученныхсогласно такому способу, заключаетсяв том, что их прочность ограничена повремени, использование же диамина в комплексе придает ему коричневый цветкоторый передается получаемой на егооснове 6-АПК, что ухудшает качество ивыход продукта.Непь изобретения - упрощение процесса и улучшение качества продукта, т. е.чтобы получаемый полимерный субстратимел большую и постоянную механическуюпрочность, бып бы более устойчив к действию щелочей, а целевой продукт небыпбы окрашен,Это достигается использованием в качестве субстрата полимера или сополимера метакриповой кислоты,Согласно изобретению 6-аминопенициллановую кислоту получают обработкойводного раствора при рН 6,0-9,0 бензилипи феноксиметиппенициппина или их солинерастворимым и воде ферментным комппексом,.состоящим из пенициплиовоФапипазы, адсорбированной на полимере ипи сопопимере метакриловой киспоты и поперечно-сшитой с помощью агента, образующего поперечные связи и выбранного из группы, включающей апьдегид гпутаровой киспоты, гпиоксапь ипи формапьдегид,Особенность предлагаемого способа - использование в качестве полимерного субстрата полимера ипи сопопимера метакриповой кислоты. При осуществлении способа желательно использовать пенициллиновую аципаэусо степенью чистоты в пределах 1530 мкмопь/мп протеина в 1 мин.15В качестве субстрата можно испопьзовать сопопимер метакриповой кислотыи дивинипбензопа ипи попимер ипи сопопимер, содержащий бензопсупьфонипьныегруппы. Обычно используют субстрат,имеющий макропористую форму. При этомферментный комплекс предпочтительноиспользовать в виде тонко измельченныхчастиц размерами 2,0-0,01 мм. Процессжепатепьно вести при 30-50 С и рН 7,0-58,5 при непрерывном ипи периодическомдобавлении гидроокиси натрия.Пенициппиновую аципазу попучаютпредпочтительно с помощью бактерий ЕвсеесЬто Соб при применении ее дня попу- ЗОчения 6-АПК из бензиппенициппина ипис помощью грибов,и актиномицетов приприменении феноксиметиппенициппина вкачестве исходного продукта.Установлено, что эффективность реакции образования поперечных связей и удельная активность полученного нерастворймого в воде энзима улучшаются при увепичении степени чистоты исходного энзима,Однако при чрезмерной чистоте этогоэнзима эффективность указанной реакциии активность попученного энзима ухудшаются, поэтому необходим экономическивыгодный предел степени очистки исходного энзима, Обычно чистота аципазы0,15 - 50 мкмопь/ллг протеина в минутупредпочтительно 15-30 мкмопь/мг протеина в минуту,Очистка энзима перед адсорбцией исшиванием достигается при нагревании56раствора энзима в течение короткого периода при температуре, равной примерно50 С, например в течение 30 мин с последующей упьтрафипьтрацией. Дпя очист 55ки энзима можно также применять фракционированное осаждение ипи обработкуионообменными целпюпозами ипи Свфарексом. Подходящим субстратом является полимер ипи сопопимер метакриповой кислоты. Такие попимеры ипи сопопим 6 ры могут содержать свободные карбоксильные группы, которые сообщают полимеру кислотную функцию. Макропористые полимеры и сопопимеры метакриповой кислоты более предпочтитепькы, чем геле- образные полимеры и сопопимеры этой кислоты.Пригодны полимеры метакриповой кислоты, не растворимые в воде и потому обычно в вийе поперечно-сшитых сопопимеров, например сопопимеров метакриповой киспоты и дивинипбенэопа, или диэфиров гпикопя и метакриповой киспоты, например диэфира этипенгпикопя и мет-, акриповой кислоты, Йпя приготовления сопопимеров можно испопьзовать и другие мономеры, например эфиры метакриповой кислоты. Одним из преимуществ данного изобретения является воэможность применения полимерных субстратов в виде продуктов, испопьэуемых в промышленности дпя других целей, например катионообменных смол спабо кислотного типа, Оссьбенно пригодны сополимеры под торговымо наименованием Амберлит 3 ЯС - 50 фирмы "Ром энд Гасс комп," США, а также сопопимер метакрицовой кислоты, выпущенный недавно в продажу под торговым наименованием Цеокарб 227 фирмой Пермутит". Последний представляет собой сопопимер дивинипбензопа и метакриповой кислоты, содержащий также бензопсульфонипьные группы. Предпочтительны попимерные субстраты в виде тонко измепьченных частиц ипи гранул, проходящих через сито с отверстиями диаметром 2,0 мм, Однако частицы получаемого комплекса не должны быть настолько мелкими, чтобы их нельзя было выделить из реакционной смеси фипьтрованием ипи применить в колонном реакторе, Частицы полимера должны быть размерами больше 0,01 мм, Выбор размеров частиц зависит от применяемой системы реакторов.Опя контактирования с полимером пенициллиновую ациназу деапизируют в водном растворе до уменьшения ионной проводимости от обычной величины 5-10 ммо до 0,1-4 ммо, предпочтительно до 1 ммо, рН раствора энэима 4,5-7,0. 11 пя достижения максимальной адсорбции и активности энэима эмпирически подбирают и устанавливают величину рН в указанных предепах. Обычно оптимапьная вепичина рН 5,2-6,5. Дпя обеспечения максимапьной вдсорбнии энэима полимер обрабатывают раствором энзимв в течение 2-16 чПосле вдсорбции нв субстрвте энзим обрабатывают агентом, образующим поперечные связи, в виде впьдегидв гпутвро вой кислоты, гпиоксаля ипиформапьдегидв, Предпочтительно применять впьдегид ипи гпиоксапь. При применении впьдегидв гпутаровой кислоты получается энзим, обладающий наилучшими свойствами при при готовпении 6-АПК. Агенты, образующие поперечные связи, обычно применяют всводном растворе при концентрации О, 1- 15 вес.% предпочтительно 0,5-5,0 вес.%,И По окончании реакции образования поперечных связей жепвтепьно удалить ицисдепвть неактивным агент, образующийсетчатую структуру. Избыток его можноуаапить при промывке водой ипи раство фром амина; очень эффективна в этом отношении мочевина.Перед применением энзимного комппекса дпя попучения 6-АПК необходимотщатеньно довести его рЫ ао величины,необхоаимой дпя этого процесса, что достигается обычно при аобавпении щепочив конце реакции образования поперечныхсвязей. Эта вепичина нежит в предепах6,0-9,0, но обычно 7,0-8,5 ипи предпочтитепьно равна 7,8. При чаком применении комплекс контактируют с воднымраствором бенэипценициппина ипи феноксиметиппенициппина ипи их сонью при опре 3%деленной вепичине рН, Температуру реакции обычно поддерживают в преаепах30-50 С,предпочтительно 37 оС. Во время реакции иэ бензипнеиициппинв выделяется фенипуксуснаякислота, а из феноксиметиппенициппинв феноксиуксусная кислота, Эти кислоты непрерывно ипи нериодически нейтрализуют апя поддержанияопредепенного передела рН реакционнойсмеси, Выбор необходимой дпя нейтрапизвции щепочи не имет решающего значения, Обычно применяют раствор гидроокиси натрия, хотя при желании можно применять такое летучее основание,как аммиак ипи триэтипамин,Водорастворимые энзимные комппексыобычно настолько стабильны мехвническци биопогически, что их можно применятьпо крайней мере дпя 40 поспеаоватешных расщеплений пенициппинв, провоаимыхв реакторе периодического действия. Приосуществлении приведенных в нрнмервхопытов применяют частично очищенныйэнзим, выдепенный механически в гомоге 654 170 бнизвторе кз клеток вырабатывающего ацнпаэу штамма Гйсйечсййз Гоб МС 1 В 8734.Остатки клеточной ткани удвшпот фипьъроввнием после установлении рН 5,0 ираствор энзимв очищают до достижениянеобходимой удельной активности, т. е.1,5-30 мкмолейlмг протеина в 1 мин,Затем раствор энзима диапнзуют до аоотижения проводимости, равной примерно1 ммо.П р и м е р 1 Аликвотные копичества(20-25 г ипи 50 г) укаэанньпс катионных и анионных ионообменньпс смол сус- пендируют в дистиплированной воде (примерно 100-500 мп) и устанавпиваютрН в предепах 4 4-6,3 в спучае катионных смол и 6,5-9;0 в случае анионныхсмол, аобавпяют гидроокись натрия иписоляную кислоту прн энергичном иеремешиввнии. Затем смолы отаелпот фипьтроввнием, тщатепьно промывают аистиппнрованной водой, суспендируют в растворе частично очищенной пенициллиновойаципазы (60-100, 250 ипи 500 мп;удельная активность 3,85-6,75 мкмоль/мгпротеина а 1 мин; проводимость менее1 ммо) и устанавливают требуемую вепичину рН, Копичество энзима, адсорбироввнного. смолой, в предепах 71-308 мкмопьсмопы в 1 мин. Адсорбция происходитпрн пегком перемешиввнии в течение примерно 16 ч и цри поадержании рН добавпением титрованного раствора. Затем смопу отдпяют фипьтрованием, вновь суспендируюч в водном растворе апьаегида гпутаровой киспочъч ( 1 ОО мл:0,825-3,3 вес,%по объему) и проводят реакцию в теченйепримерно 16 ч, Попученные комплексыэнзим-смопв выделяют,.трижды промываютаистиппироввнной водой, снова суспендируют в воде ипи 0,2 М фосфвтном буферес рН 7,8.Доводят рН до 7,8, обрабатывают в течение 1 ч водным раствороммочевины (100 мп; 0,1 М; рН 7,8) и,наконец, промывают трижды дистилпироввиной водой.Каждый из полученных энэимных комплексов применяют дпя получения 6-АПКиэ бензиппенициппинв в стандартных усповиях при рН 7,8 и температуре 37 С,Активности этих комплексов указаныв табп. 1. Активности относятся к комплексам, приготовленным при рН, оптимальном ппя вдсорбции зизимв и сохраненияего активности,Смоща Био-Рекс и Чепекс - продуктыфирмы "Био-Рва Лвборвгорис ов Квлифорнняф, США, смопы Леввтит - продукты654170 фирмы "Байер А.Г.", фРГ смолы Цеокарб иЦеропит - продукты фирмы Пермутит комп",и смолы Амберпит - ироцукты фирмы Ромзенд Гаас, филадельфия, США.Таблица Ь 10,4 Макронор 32,4 Б Гель То же 4,71 10,1 Г Стирол-полиамин Макропор 30,7 15,1 2,3 Гель Е Акрил попиамин Ж Стирол Н Макропор 39,2 19,3 йюеРа Гель 4,01 8,3 Стирол- ЬО Н Макропор 9,9 19,8 Стирол-РО Н . Гель 7;16 Макропор 37,0 88,8 Р Акрилат-СООН и 7,0 Акрилат-СООН Гель 13,9 А Стирол четвертичный аммоний.09,0 П р и м е р ы 2-5, В этих примерах показано влияние разной степени чистоты пенициллиновых энзимов на стадии адсорбции. Опыты проводят аналогично примеру 1. Энзимы абсорбируют прирН 5,7 икомплекс энзим-смола обрабатывают 3,3 весЛ по объему) раствором альдегида глутаровой .кислоты. Применяют смолу Амберпит ЯС 5,0, которую промывают щелочью, а затем кислотой.Полученные удельные активности комплексов приведены в табл. 2. Эти результаты показывают, что при увеличении сте" пени чистоты исходного энзима в определенных пределах увеличивается удельнаи активность комплекса.Табпица 2,4 16 е р ы 16, 17. Эти примерывают влияние частиц смолы разныхПрименяют смолу Амберлитроматографического сорта,лу Амберлит С 6-50 типа 1 спроходящими через сито сми диаметром 0,149 мм, но заи м казь размеров 1 Ст. е. смочастицами отверстия П р и м е р ы 6-15. В этих примерах пЬказано значение величины рН, при которой энзим адсорбируется на смопе.А, Устанавливают рН пяти апиквотных количеств смолы А мберпит 1 Я С -50 - 3 84,9 5,1 5,3 5,5 и 5,7. Смолу высушивают и каждый образец добавпяют к .раствору частично очищенной пеницилпи,новой аципазы (активность 60,9 мкмоль/ /мп в 1 мин, 95 мп; 16,8 мкмоль/мц 10 протеина в 1 мин; проводимость 0,55 ммо; конечный объем раствора 200 мп). Поспе адсорбции при подходящей величине рН в течение 16 ч комплекс обрабаты,вают енапогично примеру 1.15Б. Еще пять аликвотных количеств той же смолы обрабатывают таким же способом, но адсорбция проходит при рН 5,7-6,5. Испопьзованный энзим имеет следущие характеристики: 105 мл, актив О ность 54,7 мкмопь/мл в 1 мин;9,03. мкмопь/мд протеина в 1 мин; про- водимость 0,75 ммо).Резулматы экспериментов приведены итабп. 3. Иа табащы видно, что оптималь,нал дна адсорбции вепичина рН 5,2-5,8,Табпица 3,. держиваемыми на сите с отверстиямидиаметром 0,074 мм,А пиквотные количества ( 15 г) смолыадсорбируют энзим (200 мл; 23,7 мкмоль//мл в 1 мин; 3,86 мкмоль/мг протеинав 1 мин) при рН 6,3 в течение 3 ч.Полученные комплексы отделяют и промывают аналогично примеру 1. Активностьпродукта (21 г) равна 114,5 мкмоль/гв минуту (сухой вес), При сравнении этого продукта с продуктом полученным вримере 2 при примененйи АмберпитаУРСс частицами, размеры диаметровкоторых 0,297-1,41 мм, установлено,что пучшие резупьтаты достигаются приприменении смолы с меньшими размерами частицЭтот эксперимент повторяют с при.менением смолы Амбериит фармацевтического сорта, т. е. Амберпит 1 РРсчастицами диаметром 0,037-0,149 мм,Смода адсорбирует энзим (3920 мкмоль/гв 1 мин) при рН 6,3, Энзимный комплексреагирует с альдегидом глутаровой кислоты (3,3 вес.%, по объему). Затем егообрабатывают аналогично примеру 1. Полученный комплекс энзим/смола имеет удельную активность, равную 478, 4 мкмоль/ги 1 мин при сухом весе.П р и м е р 18. УстанавливаюгрН 5,5смолы Амберпит ИГпромывкой 0,2 Мфосфатным буфером с такой вепичинойипи при суспендировании ее в дистиллированной, воде с добавпением раствора гидроокиси натрия, Затем смопу допопнитепьнопромывают дистиллированной водой попостоянной проводимости воды.Сырую воду. (100 г) добавляют к пенициппиновой аципазе с активностью 5,25мкмопь/мг протеина в 1 мин в 500 мп0 02 М фосфатного буфера при рН 5,5и перемешивают 20 ч при комнатной температуре. Отдепенное фильтрованием твердое вещество снова суспендируют в 500мп 0,25 О/о-ного (по весу на объем) раст-вора апьдегида гпутаровой кислоты в фосфатном растворе и допопнитепьно перемешивают 20 ч при комнатной температуре.Попученный комплекс отдепяют фильтрованием и промывают 0,2 М растворомфосфатного буфера при рН 7,8 до установпения. этой величины рН во всей массес моды.Полученный комппекс смопа-энзим15 г) испопьзуют для реакции с 200 мп6,25%-ного водного раствора бензиппеницидлина в 0,02 М растворе фосфатногобуфера при рН 7,8 в течение 2 ч при, о37 С, Установлено, что этот комплексможно легко отделять пля использованияеще 25 раз, так как он механически ибиологически прочен,Г 1 р и м е р 19, В этом примере пока занв возможность применения энзимногокомплекса для проиэовдства 6-АПК вбольшом масштабе при многократном использовании в этих условиях,Комплекс приготовляют из смолы Амберпит 3 КС, Активность смолы26,3 мкмоль/г в 1 минуту. В качествеисходного продукта используют 40 и6,5%-ного раствора бензиппенициппинвв 0,02 М фосфатном буфере. Комппекс Будерживают в реакционном сосуде с помощью проволочной сетки, По окончанииреакции раствор попученной 6-АПК профипьтровывают, комппекс промывают водой и используют пля следующей реакции, Средняя эффективность конверсиидо 6-АПК при 50 поспедоввтепьных реакциях в течение 6 ч равна 95%.П р и м е р 20. В этом примере сравнивается механическая стабильность энзим-ного комплекса, предусмотренного данным изобретением и приготовленного согласно примеру 1 из смолы Амберлит ТЕС,еи комплекса, приготовленного тем же способом, но из полимерного субстрата с нейтральной активностью, в именно из смолы ХАЮ -7, т. е. поперечно-сшитого акридатного эфира фирмы "Ром энд Гавс", США.Образцы каждого комплекса (1,6 г) суспендируют в 8 д 0,2 М фосфатного буфера при рН 7,8 и 37 С,и затем каждую суспензию перемешивают 72 ч при 200 об/мин в бродипьном чане с перегородками. Пробы отбирают через каждые 4 ч и визуально наблюдают разрушение частиц смолы. Разрушений частиц ХАП -7 значительно больше, чем частиц Я 1-60. Проба поспедней смолы, отобранная через 64, ч показывает большую механическую прочность смопыЯС -50.П р и м е р 21. Амберлит ЭЯ 0 -50 (235 г; 39,4 мкмоль/г в 1 мин) приготовляют аналогично примеру 1 и используют дпя реакции с 6,25%-ньм раствором натриевой сопи бенэилпенициппинв при 10 поспеаоватепьных экспериментах.Каждый эксперимент проводят, применяя 1 л раствора бензилпенициппина при реакции в течение 2 ч 30 мин при .37 С и рН 7,8. По окончании каждой реакции смолу отфильтровывают и промывают аистиппированной водой, фильтрвт и промыв ную воду концентрируют во вращающемся вакуум-пспвритеде. Концентрат смешивают с равным объемом метипиэобутипкетона, охлаждают до 4-10 С и подкиспяют дпя осаждения 6-аминопенициддвновой киспоты. Зту кислоту промывают небольшим копичеством дистиллированной воды, опопаскивают 1, ацетоном и сушат. Средний выход 6-вминопеиициддановой кислоты в 10 экспериментах равен 9 13%.П р и м е р 22, Аасорбция аципазного энэима нв попиэтипене, покрытом мочевиной.Частицы попиэтипена низкой ппотности (примерно 400 мкмопь)покрывают попимером уретана (Уретан 641 Ю фирмы Грей Валди Продактс Лимитед ) исушат в течение 10 дней, Зтот йродукт промьФ- вают в течение 1 ч 2006-ным по объему водным ацетоном, затем тщатепьно дистиллированной водой и апиквотные копи чества (5 г) испопьзуют дня адсорбции лизима (125 мд; 54,0 мкмодьУмд в 1 мин;. 3,80 мкмоль/мг протеина в 1 мин) в течение 5 ч при рН 4,8-9,0.Покрытые уретаном частицы отфильтровывают, обрабатывают в течение 3 ч раствором альпегида глутаровой кислоты (75 мп;3,3 вес.%, по объему) и поводят их рН до 7,8 анвпогично примеру 1.Несмотря на то, что покрытые уретаном частицы меньших размеров, чем час- тицы 3 ЯС, достигнутая удепьная ак- тивносМ в 2-3 раза меньше активности, попученной при примененииЖС.Реэупьтаты привеаены в табл. 4. Твбпица 4.,рия,Источники информации,внимание при экспертизе 7 7,0 7,5 8,0 8,5 ятые в 50 1. Выложенная заявка фРГ %2143062, кп, С 12 П 13/10, 02 0302,03.72,9.0,3 ИИПИ Заказ 1329/46 Тираж 512 филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул, Про одписное ая, 4 П р и м е р 23. Адсорбция аципазы на найлоне.Орголак (порошкообразный найпон 6 диаметр частиц 30 мкмопь,фирма Ато Вимм Лимитед (Великобритания),промывают в течение 1 ч 65%-ным раствором муравьиной кислоты, а затем тщательно дистиллированной водой. Аликвотные количества продукта (10 г) используют для адсорбирования энзима (100 мл; О 50,9 мкмоль/мл в 1 мин; 4,7 мкмоль/мг, протеина в 1 мин в течение 16 ч прирН 4,8-9,0. Порошкообразный найлон огфипьтровывают, обрабатывают альдегидом гпутаровой кислоты (100 мп; 3,3 О/ный раствор) в течение 3 ч выделяют и промы 1вают аналогично примеру 1. Достигают высшую активность, равную 41,7 мкмоль/г в 1 мин при рН 4,8 и сопоставимую с обычно достигаемой при применении 12 С, Однако с учетом разницы размеров частиц найпона и ЗЯБ -50 последняя смола дает пучщие результаты, Так, например 1 РР(фармацевтический сорт ХРС50; размеры частиц 0,037-0,149 мм)2 можно сочетать с ацилазой дйя попуче ния препаратов с удепьной активностью 478 мкмопь/г в 1. мин в сыром весе, т, е. более чем в одиннадцать раз пре 30 вышающей активность найлоновых препаратов.Резупьтаты приведены в табп. 5.Табпица 5 формула изобретения 1. Способ попучения 6-аминопенйциллановой кислоты путем обработки водногораствора бензилпенициппина или феноксиметиппенициллина или их сопи при РН6,0-9,0 нерастворимым в воде ферментным комплексом, состоящим из пенициплиновой ацилазы, адсорбированной на нерастворимом в воде полимерном субстрате, и поперечно-сшитой с помощью агенобразующего поперечные связи и выбранного из группы, включающей альдегидгпутаровой кислоты, глиоксаль или формаль.дегид, о т л и ч а ю щ и й с я тем,что, с целью упрощения процесса и улучшения качества продукта, в качестве попимерного субстрата, используют полимер ипи сополимер метакриповой кислоты,2.Способпоп. 1, отличающ и й с я тем, что используют пеницил-линовую ацилазу со степенью чистотыв пределах 15-30 мкмоль/мг протеинав минуту,3. Способ по пп,1 и 2, о т л ич а ю щ и й с я тем, что используютсубстрат, имеющий макропористую форму.4. Способ по пп. 1, 2 или 3, о тл и ч а ю ш и й с я тем, что в качестве субстрата используют сополимер метакриловой кислоты и дивинилбензола.5, Способ по п. 4, о т и и ч а ющ и й с я тем, что указанный. полимерипи сополимер содержит бензолсульфонипьные группы.6. Способ по пп. 1-5, о т л и ч а ющ и й с я тем, что ферментный комплексприменяют в виде тонко измельченныхчастиц размерами 2,0 0,01 мм.7. Способ по пц. 1-6, о т и и ч а ющ и й с я тем,чтопроцессведут при 3050 С ирВ 7,0-8,5 при непрерывном илипериодическом добавлении гидроокиси нат