Способ получения бактериальных аллергенов

Союз СоветскихСоциалистическихРеспублик ОП ИСАНЙЕИЗОБРЕТЕН ИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ 1 а 79379(53) УДК 4576.8 . 097,2. (088.8) Опубликовано 30,12.80, Б 1 оллетень48 Дата опубликования описания 31.12.80 А. Н. Маянский, И. Е. Алатырцева, Б. А. Молотилов,И, В, Молчанова и В, М. Лукашков(72) Авторы изобретения Казанский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии( 54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬН ЫХ АЛЛЕРГЕНОВИзобретение относится к медицинскойпромышленности и касается получениябактериальных аллергенов,Известен способ получения бактериальных аллергенов путем выращиваниямикроорганизмов в жидкой питательнойсреде с последующим отделением биомассы, выделением целевого продукта путемосаждения из надосадочной жидкости,растворением осадка, его очисткой и стерилизацией ) 1.Однако известный способ не обеспечивает высокой специфичности аллергенов.(Содержание белка в 1 диагностическойдозе аллергена; для золотистого стафило 15кокка 60-130, кишечной палочки 35-75стрептококка группы А 15-30, протеямирабилис 4-12 мг).Цель изобретения - повышение специфичности аллергенов,26Достигается это тем, что растворенныйосадок очищают с помощью гель-хроматографии и выделяют фракции с мрлекулярным весом выше 30000. Способ осуществляют следующим образом.Приготавливают маточные культуры. Йля изготовления используют сухие штаммы культур соответствующего вида. Штаммы высевают раздельно в пробирки с питательным бульоном и выращивают при 37 С в течение 18-20 ч, после чего пересевают на мясо-пептовый агар.После двух пассажей делают высев на серийную питательную среду, состоящую из смеси бульонов Мартена и Хоттингера с добавлением 0,2% глюкозы и рН 7,2-7,4 Бульонную культуру через 18- 20 ч выращивания проверяют на чистоту путем микроскопии.Питательные среды, разлитые в матрацы по 50 мл, засевают 18-20 часовыми бульонными культурами, Плотность посева 100-150 млн микробных тел на 1 мл сре ды. Матрацы хорошо перемешивают и поо мещают в термостат при +36-1-37 С во наклонном положении под углом 10-20 Через 5-6 суток культуру из каждогоматраца проверяют на чистоту путем микроскопирования, затем центрифугируютв течение 1 ч при 3000 об/мин, Супернатанты иэ культуры разных штаммоводного вида объединяют,Супернатант, охлаждаемый до +4-+7осаждают 98%-ной уксусной кислотой.прирН 4,0-4,2. После выдерживания подкисленного супернатанта при +4-+7 В в течение 24-48 ч, осадок отделяют цвнтрифугированием при 5000-6000 об/минв течение 15 мин, Надосадочную жидкость осторожно сливают, Осадок дважоды отмывают охлажденным до +4-+7 Сфизиологическим раствором с рН=4,04,2, затем растворяют боратнобуфернымраствором с рН=7,0-7,2, который добавляютиз расчета 1/100-1/500 относительнообъема осажденного супернатанта доводят рНпо 7,5-7,8 добавлением 30%-ного раствораЙаОН и оставляют в холодильнике при+4-+7 С на 24-48 ч,эатем препаратподвергают гель-хроматографии на колонке с сефадексом Гили молселектом.Фракция, очищенная от иммунологическиинертного балласта, элюируется под контролем спектрофотометрии при 280 нмв виде первого пика, соответствующегосвободному объему геля, Препарат стериолиэуют автоклавированием при 110 С втечение 30 мин.После проверки стерильности и безвредности препарат разводят на кожные дозыпо содержанию единиц белкового азота( 0,1 мг белкового азота соответствует10,000 Р ЙИ),Содержание Р ИН в 2 мл и степеньспецифической активности для каждоговида аллергена регламентированы действующими ТУ, Специфическую активностьразведенного аллергена проверяют методом внутрикожных проб на больных синфекционно-аллергическими заболеваниями, йри которых возможна сенсибилазация к данному виду микроорганизмов,45П р и м в р. Получение аллергенакишечной палочки. В качестве исходногопродукта для получения очищенного аллергена кише Зной палочки используютконцентрированный маточный аллергендвух штаммов кишечной палочки (штаммы2-ЧП и 1-6 .), который являетсяосновой препарата диагностического аллергена кишечной палочки. Культуры выращивают б суток при +37 С на жидкой питао35тельной среде, состоящей иэ одной частибульона Мартена и двух частей буьлонаХоттингера, Бульонную культуру подвергают центрифугированию в течение 1 че 79 фпри 3000 об/мин, Супернатант осаждают98%-ной уксусной кислотой при рН - 404,2, Осадок отделяют центрифугированиемна холоде в течение 15 мин при 5000об/мин. Надосадочную жидкость сливают,а осадок отмывают охлажденным до +4- о= 4,0-4,2, а затем растворяют баратнобуферным раствором с рН=7,0-7,2, израсчета 1/100 исходного объема супернатанта. После тщательного перемешивания рН доводят до 7,0-7,2 добавлением30%-ного раствора М аОН,Препарат подвергают хроматографиина колонке с гелем сефадекса Г, Свободный объем колонки предварительноопределяют при помощи элюирования высокомолекулярного соединения (голубойдекстран Т), На колонку размером25 х 800 мм наносят 10 мл препаратаи проводят элюирование боратно-буфернымраствором при рН = 7,2, Пробы элюатаобъемом 5-6 мл объединяют под контролем спектрофотометрии при 280 нм.оЙля колонки с гелем сефадекса 25 хх 800 мм свободный объем составляет80-88 мл. Фракцию 1 стерилиэуют автоклавированием при 110 С в течение 30мин. Препарат проверяют известнымиспособами на стерильность и безвредностьопределяют содержание единиц белковогоазота. Стандартизируют препарат в кожных диагностических дозах, За 1 диагностическую дозу принимают разведениеаллергена с наименьшим содержанием(400 РМ И в 1 мл) белкового азота,вызвавшее положительные внутрикожныереакции у 40-60% больных с инфекционно-аллергическими заболеваниями, в патогенезе которых имеет значение сенсибилизация к кишечной палочке ( хроническиезаболевания желудочно-кишечного трактас аллергическим компонентом),С фракцией 1 выходит около 50% белка, содержащегося: в цельном препарате.Основу фракции 1 составляют белковыекомпоненты с молекулярным. весом более30,000 (80-85%), связанные с небольшим количеством углеводов (5-8%), нуклеиновых кислот (6-12%) и липидов(О, 5-1%).Практически все антигены элюировались в составе фракции 1 (мол.вес30,000), последующие фракции (мол,вес30,000) были иммунохимически инертныфракция 111, или слабо активны - фракция 11.При внутрикожном тестировании на морских свинках, сенсибилиэированных к цельСоставитель С, МалютинаРедактор Т. Кузьмина Техред Н,БабуркаКорректор В. Бутяга Заказ 9159/6 Тираж 673 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж 35, Раушская наб., д. 4 Юфилиал ППП "Патент, г.Ужгород, ул. Проектная, 4 5 79 ному аллергену кишечной палочки, почти вся активность была связана с фракциейИспользуя предлагаемый способ были получены очищенные раствоимые аллергены золотистого стафилококка, стрептококка группы А, кишечной палочки и протея мирабилис.При испытании этих аллергенов в клинических условиях установлена их высокая специфическая активность при значительно меньшем, по сравнению с коммер . ческими препаратами, . содержаний белка в 1 кожной дозе препарата. Для аллергена золотистого стафилококка содержание белка в 1кожной дозе снижено в 4 раза, для аллергена стрептококк .ка группы Ав 6 раз, для аллергена кишечной палочки и для аллергена протея мирабилис - в 2 раза,Предлагаемый способ позволяет получать более стандартные препараты бакте 1379 6 риальных аллергенов, используемых в практике эдравоохранения. формула изобретения Способ получения бактериальных аллергенов путем выращивания микроорганизмов в жидкой питательной среде споследующим отделением биомассы, выдвлением целевого продукта путем осажде 1 О ния из надосадочной жидкости, растворением осадка, его очисткой и стерилизацией, отличающийся тем,что, с целью повышения специфичностиаллергенов, растворенный осадок с помощью геа хроматографии и выделяютфракции с молекулярным весом вышеЗОООО,Источники информации,принятые во внимание при эксперитэе1. Справочник по применению бактерийных и вирусных препаратов, М., 1975,с. 56-57.