Способ получения основы для иммобилизации белков

пктек;,; 6 Союз Советских ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ полнительное к авт,1) М,Кл.з 6 01 И 31/08 С О 8 В 37/12/ С 07 СЬ 7/00(43) Опубликовано 30.12,81. Бюл Государственнын комит СССР по делам изобретенийтетень48 ия 30.12.81 ткрыт опубликования опис 5 72) Авторы изобретени Кузовлев Ордена Трудового Красного Знамени научносследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н. ф. Гамалеи АМН СССР(71) Заявител 4) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОСНОВЫ ДЛЯ ИММОБИЛИЗАЦИИ БЕЛКОВ Известен также способ, основанный на присоединении к атару такого вещества-" связки, которое не меняет способности агара образовывать гель и содержит ароматнческую аминогруппу. Способ заключается во взаимодействии агадира или агарозы и сернокислого эфира 4+оксиэтилсульфонил-аминоанизола;при 75 С. Полученный продукт отмывается на несколыких слоях марли водой. Приготовленяая таким способом основа спосо 1 бна иммобилизовать до 300 мг белка на 1 г своего,веса 21.Недостаткой данного способа является недостаточно высокая способность основы иммобилизовать белки. Кроме того продукт содержит ряд труднараспворимых примесей и не обладает достаточной стабильностью, так как мелкие частицы агарозы вымываются вместе с труднорастворимыми примесями. Присутствие этих труднорастворимых примесей в основе недопустимо, так как они содержат ахроматическую аминогруппу и могут конкурировать с основой за белок,в процессе,иммобилизации. О Кроме бации м полному неп,р:игод ни Изобретение относится к области молекулярной биологии, биохимиииммунохимии.Основными требованиями, которым,должны удовлетворять основы для иммобилизации белков, являются высокая степень сохранения биологической активностииммобилизованных белков и достаточновысокая способность основы иммобилизовать большие количества белка, 16Известно, что,в наиболее высокой степени сохраняют свою биологическую активность белки, иммобилизованные на основах, имеющих структуру геля. Сырьем дляприуготовления таких основ служат ага 1 рил,и ага.роза,Известно несколько способов синтезаоснов для иммобилизации белков, приуготовленных из. агара или агарозы, в частности шведская фирма Р 1 тагтпаса Г 1 пе 2СЬепт 1 са 1 в выпускает основу, получаемуюпри присоединенни ц 1 ианбромида к определенным образом приготовленному гелюатарозы (СХВг-сефароза) Ц.25Недостатком способа является относительно ввизкая способность основы иммобилизовать белки (30 мг белка на 1 г ос;новы),и необходимость иотвользования высокотоксичБого бромциана.30 того, высокая температура,инку жет привести к частичному или смолению основы, что делает ее ой для дальнейпего ,использова3,щ:-"ту 1Цель изобретения - увеличение епособвости основы иммобилизовать белки,- Это достигается тем, что нроцесс синтеза проводят при 20 - 50 С, а отмы 1 вку основы ооуществляют 2 - 10%-ным раствором НС 1,Такая основа может быть использована- для тех же целей, чтои С 1 ЯВг-сефароза,выпускаемая, за рубежом, а имеино, для=" "выделенйя по аффиинитету,различных веществ,и для специфического их удаленияиз сложных смесей, а также для количест,вейного определения антител,и антигенов,что может найти ор)изменение в клинике.Крометого"устанонлено, что основа, при гбтовлейная из агара или агарозы описываемым способом, может использоваться в"тех случаях, когда никакие другие основыиспользоваться не могут. Сущность этого,прнема заключается в том, что иусочек геля с иммобилизованньпм на нем белкомвноойтся в слои ген амара-иди"ата 7 розьт, вкотором затем можн 1 о п;роводить любыере ЙЙОГЙ;"Мфоводймйе" 3 геля 7 мйФГрафйлиагарозй. Таким образом становится возможным сочетать метод аффинной сорбциис любым методом, связанным,с использо"6 анием мя агара или "атаровы.Способ позволяет получать основу дляиммобилизации белков, сиособиую иммобилизовать .в 2 раза болыше белка, чем"ос-нова, полученная известньгм способом.Повышейие емкости основы по белкуобусловлено:в,основном снижением температуры реаиции, что позволяет избежатьосмолейия продукта лри длителыной,инкубации. " "Недопустимые,в основе примеси, способные конкурировать с неи за белок, удаляютотмывкой 2 - 10%-ной раствором НС 1, адля получения высокого и стабильного выхода отмывку ведут обычно лри цен"прифугировании.Пр и м е р 1. К 20 мл 9%.ного раствораИаНСО," приперемешивании добавляют0,6 г аерекристаллизованногокоммерческого серноиислого эфира 4-р оксиэтилсульфонил-аминоанизола (ОЭСАА). Раствор отфильтровывают и добавляют 3 г агарозы Азавода Оляйне, Через 1 ч жидкость отфильтровывают на бкинеровсиой воронке,а остававшийся на фильтре материал переносят н чанпку Петри диаметром 5 см, заиры" "вают, помещайтетермостат и инкубируютпри 37 С в течение 3,5 суток. После инку- бации материал отмывают при центрифуги " =рсваний дис пиллированнои водои при 55 - ,60 С, затем 2 раза 5%-ньпм раствором НС 1,после чего,многоиратно водой до нейт - ральных промывных вод-, "Получеиную основу для иммобийИЩйисушат ДопостояйнЖо веса,Количество остатков ОЭСР, присоедитпиюпииа т ятд.ооъ гппапа пяют пд,1 гп пи честву входящих в нх состав ароматических аминжрупп. Для этого к 0,5 г пол 1 ученной основы добавляют 20 мл 5% ного раствора НС и 400 мг КаИОг,после инкубации на ледяной бане в течение 30 мин полеченное производное отмывают до рН 8,6и добавляют 20 мл насыщенного раствораД-,нафтола. Через 1 ч образовавшийся ярко-розовый продукт отмывают водой,и вы 10 сушивают. Высушенный лрепарат растворяют в 90%-ном распворе Нг 504 .из расчета 0,5 мг/мл и окраску раствора фотометрируют,при 560 ммк.Проводят иммобилизацию у-глобулина15 лошади. Для этого из основы готовят 1%ный гель, его помогенизируют и иииубируют при 4 С в течение 30 мин в среде 5%ного раствора НС и 2%-ного раствораКаИОг, гель отмывают до,рН 86 и добавО ляют 1-глобулин. Через 48 ч инкубации при4 С определяют количеспво белка, оставшетося в растворе,-и рассчитывают количество белиа, иммобилизовавшегося на единицувесаоснбвы. На 1 т основы удается иммобилизовать 636 мг белка,Пр имер 2. В условиях, описанных впримере 1, приготавливают оонову. Синтезотличается лишь тем, что,иниубацию при37 С проводят не 3,5 суток, а 6,5 суток,Описанным в примере 1 способом оп ределяют количество остатков ОЭСАА, присоединившихся к агарозе, В этих условияхсинтеза получают основу с емкостью,в:3,9раза выше, чем емкость основы; подученной известным опособом, Недопустимые- примеси в основе отсутствуют. Выход 47%.П,р и м е р 3. Б условиях, описанных впримере 1, готовят основу для иммобилизации белков. Синтез отличаепся лншь тем,4 О что инкубацию проводят при 20 С в течение 18 суток.Полученная основа содержит,в 1,7 раза больше остатков ОЭСАА, чемпри синтезе,в условиях, описанных в прототипе. Недопустимых примесей не содер 45 жит, осмолеиия не наблюдается. Выход52%,При.мер 4. Препарат по примеру 1,но иниубацию проводят в течение 2 сутокпри 46 С. Полученная основа содержит в2,6,раза больше остатков ОЭСАА, чем присинтезе в условиях, описанных,в прототипе. Недопустимых примесей нет, осмоленияне наблюдается, Выход 46%.Таиим образом, одисываемый способпозволяет, используя отечественное,иди импорпное сырье; приготовить основу, содержащую в 3 - 4,раза большие количестваостатиов, ОЭСАА,и способную,в связи сэтикам иммобилизовать, по ирайней мере, в5 О 2 раза большиеколичества белка, чем основа,"1 припотовленная из импортното сырьяизвестным способом.Описываемый способ отмывки такой основы 2 - 1 О%-нойо раствора НС 1 дает воз 65 можнпатк спалить точлнопдатвооимыа пои776245 Фор мул а изобретения Составитель О. Скородумова Техред 3. Тараненко Корректор С, файн Редактор Л, Горькова Заказ 32/39 а Изд,654 Тираж 915 ПодписноеНПО Поиск Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушскаи наб., д. 4/5 Тип. Харьк. Фил. пред, Патент меси, способные конкурировать с основой за белок в момент дммобилизации. Отмывка при центрифупцровании позволяет получить высокий и стабилыный;выход готового продукта,Способ приготовления основы годен для передачи,в производство,Слособ получения основы для,иммобилнзации белков аутем взаимс 1 действия агара или агарозы с сернокислым эфиром 4- р-оксиэтилсульфонил-аииноанизола ори повышенной температуре с последующей отмывкой основы водой, о т л и ч а ю щ и йся тем, что, с целью увеличения опособности основы,иммобилизовать белок, процесс проводят прн 20 - 50 С, после чего осуществляют пгредварительную отмывку полученной основы 2 - 10%-ным,раствором 5 НС 1. Источники иноформации, вринятые вовнимание при экспертизе: 10 1. Ашпйу СЬгогпа 1 одгарйу, ВооЫе 1,- .Р 11 аппас 1 а Р 1 пе СЬегпЫгу, Яжедеп, 1977.2, Кузовлева О. Б, Выделение индивидуальных белков дри аомош 1 и новых имму носорбентав, способных приооедияять большие количества антнгена ДАН, СССР, 2 ОЗ, 5, 1972, с. 1193 в 11 (прототин),