Способ стабилизации ферментных препаратов

Союз Советских Социалистических Республик(51)М, Кл.2 С 12 О 13/10 Государственный комитет СССР но делам изобретений н открытий(54) СПОСОБ СТАБИЛИЗАЦИИ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ Изобретение относится к биохимической технологии, а именно, к способам стабилизации препаратов, применяемых в медицине, научных исследованиях и в пищевой промышленности.Известны стабилизирующие агентыразличного типа: буферные смеси,соли, глицерин,сывороточный альбумин,кислородсвязывающие агенты,диамины,гормоны,нуклеиновые кислоты,хелатные 10агенты, образующие комплексы с тяже- .лыми металлами, тиолы и др. (1).Наиболее близким по своей технической сущности к изобретению является способ стабилизации ферментных 15препаратов, предусматривающий использование р -меркаптоэтанола (2)Однако стабилизирующий эффект р. -меркаптозтанола для ряда ферментовзначителен только при совместном 20действии с комплексообразователями(например, ЭДТА) .Кроме того-меркаптозтанолвещество токсичное, с резким запахом,отрицательно действует на нервную 25систему, загрязняет окружающую среду.Целью изобретения является повышение активности ферментов и предотвращение заражения окружающей средытоксичными веществамИ,Поставленная цель достигается тем, что в качестве соединения, связывающего ннгибирующие ферменж вещества, используют 8-меркаптохинолин в количестве 25-125 мкм/г фермента.8-Меркаптохинолин(тиоксин) С НтКЯ имеет структурную формулу8-Меркаптохинолин - тиолсодержащее соединение, обладает хелатными свойствами и стабилизирует ферменты по двойному механизму за счет защиты ЯН-групп активных центров фермен.та от окисления и связыванием ионов тяжелых металов - ингибиторов, что позволяет выделять ферментные препараты с наименьшими потерями, предотвращая загрязнение окружающей среды токсичными веществами.П р и м е р 1, 100 г обезжиренной соевой муки экстрагируют 400 мл смеси 0,05 М ТРИС-буфера в 36-ном этиловом спирте (рН,2), в которую предварительно добавляют 4 мл 2 52т 10 М раствора 8-меркаптохинолина в этиловом спирте, Время экстракции740825 О 59 11,5 950 б,б 1100 73 11,5 6,8 1700 96 11,5 2,26 4,1 5,5 7,0 5,5 87 4,0 составляет 1 ч при температуре 20 ОС.Полученную суспензию фильтруют, к320 мл фильтрата добавляют 640 мл охлажденного до 4 С этилового спирта,в который предварительно вносят 6,4 мп2,510 М спиртового раствора Я-мер-,каптохинолина. Через 3 ч надосадочную жидкость декантируют. Полученный осадок растворяют в 1-номрастворе цитрата натрия до конечного объема 200 мл и фильтруют.Иэ полученного фильтрата уреазуохлаждают 600 мл охлажденного до 4 Сэтилового спирта, в который предварительно добавляют 6 мл 2,510 Мраствора 8-меркаптохинолина в этиловом спирте. Осадок промывают холодным ацетоном, затем высушивают. Получают,6,5 г уреазы с удельной активностью 1700 ед, Самнера на 1 г белка.При хранении препарата в течениегода при комнатной температуре потери активности не превышают 5 отисходной,П р и м е р 2, 100 г сухих дрож -жей Бассйагощусез 1 гаЧ 111 з экстрагируют 1 л10М Фосфатного буферарН - 6,9, в который предварительнодобавляют 20 мл 2,5 ф 1 ФМ 8-меркаптохинолина в этиловом спирте, Времяэкстракции 8 ч при температуре 20 фС,Суспензию центрифугируют, полученныйосветленный раствор концентрируютв 5 раз с использованием ацетатцеллюлозной мембраны УАМ 300, концентрат проьывазют диафильтрацией двойнымобъемом 10 М Фосфатного буфера, содержащего 0,5 МЧС 1 , К .200 мл концентрата добавляют 200 мл глицерина,в который предварительно добавляют"Я4 мп 2,5 10 И раствора 8 меркаптохинолина в этиловом спирте.Удельная активность полученногоферментного препарата составляет7 ед/мг белка, концентрация белкалМг/мл,Уреаза без стабилизирующегоагента о -Р -2Уреаза 2 10 М МКЭ + 2 10 ИЭДТА-Галактозидаза 510 И -МКХ (125 мкМ на 1 г Фермента) После хранения ферчентного препарата в течение 5,5 мес. при 40 С потери активности не превышают .13 от исходной. В таблице представлены результаты сопоставления стабилизирующего эффекта 8-меркаптохинолина (8-МКХ) и меркаптоэтанола (МКЭ) с ЭДТА,Из таблицы следует, что для стабилизации уреазы требуется в 100 раз меньшая (молярная) концентрация 8- меркаптохинолина по сравнению со смесью меркаптоэтанола и ЭЦТА, причем потеря в активности фермента эа один и тот же срок хранения при комнатной температуре снижается с 27 до 4. При стабилизации-галактозидазы предлагаемым агентом требуется в 10 раз меньшая (молярная) концентрация, чем-меркаптоэтанола, причем удельная активность Фермента при очистке с предлагаемым стабилизатором возрастает в 1,6-2 раза, а потери активности при хранении фермента снижаются с 25 (стабилизатор меркаптоэтанол) до 13.Предлагаемый стабилизатор как не- летучее и нетоксичное соединение обеспечивает охрану окружающей среды при стабилизации Ферментов, исключая применение токсичного,с резким запахом, действующего на центральную нервную систему,Технико-экономический эффект предлагаемого технического решения заключается в обеспечении стабилизации Ферментов, в частности, уреазы и -галактоэидазы в технологическом процессе выделения и очистки, а также в процессе их хранения.Экономический эффект составит 170 тыс.руб в год7408.".5 Формула изобретения Составитель Н.ПаниковТехред М.ПеткоКоРРектор В.Бутяга Редактор Н. Потапова Тираж 522 Подписное цНИИПИ Государствениого комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, РаушскаЯ наб., д. 4/5Заказ 3154/31 филиал ППП Патентф, г. ужгород, ул. Проектная, 4 Способ стабилизации ферментных препаратов, предусматривающий введение соединений, связывающих ингибирующие ферменты вещества, о т д и ч а ю - щ и й с я тем, что, с целью повн- щения активности ферментов и предотвращения заражения окружающей среды токсичными веществами, в качестве соединения, связывающего ингибирующие ферменты вещества, используют 8-меркаптохинолин в количестве 25125 мкМ/г фермента.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1.Мвещап О.А,1 пдцвгг 1 а 1 ЕпгувеЯ 1 аЬ 111 вай 1 оп, - Л. Ргосевв В 1 осЬевев 1 гу, рр.14 т 15, 19732, Йопд В.Ь., Яйоге С,11. 81 пд 1 евгер рцг 1 Й 1 саС 1 оп оГ цгеаве ЬуаЕГ 1 п 11 у сЬгдпаСодгарЬу. - СапаМапЯ.М 1 сгоЫо 1 оду, ч.20, рр,624629,1974,