Способ одновременного получения ингибитора протеазы и гепарина

ОП ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН ИЯ Союз Советских Социалистических Республик(32) 05.10.7 осударстаенныи хамит Соаета Иинистроа ССС по делан изобретенийи открытий) Дата опубликования описания 19,05,78 Иностранцы Джанфранко Федели и ЛАмбрози Иностранная фирмаборатори Деривати Органичи,А. 1) Заявит 54) СПОСО ОВРЕМЕННОГО ПОЛУЧЕНИЯ ИНГИБИТОРА ПРОТЕАЗЫ И ГЕПАРИНА Изобретение относится к вопросам биохимии, а именно к способам получения ингибитора протеазы и гепарина.В основном эти препараты получают раздельно двумя самостоятельными технологическими процессами. Решение проблем получения указанных препаратов связано с определенными трудностями; это и сложность технологии известных способов, основанных в основном на экстракции и селективном эффекте кислотных и щелочных водных смесей, солевом и/или водноспиртовом фракционировании и метбдах хроматографии, необходимость проведения большого числа операций, довольно низкий выход конечных продуктов и, следовательно, высокая себестоимость, а также недостаточная 1 чистота получаемых препаратов и загрязнение окружающей среды.Решена проблема и одновременного получения ингибитора протеазы и гепарина. Согласно извест. ному способу проводят лизис животного сырья путем автолиза охлажденной до 8 - 12 С водой, затем лизис прекращают, разделяют лизат центрифугированием на жмых. и жидкую фазу, содержащую ингибитор протеазы, Из жидкой фазы высаливают балластные белки, после чего их отделяют 25 2фильтрацией и из фильтрата осаждают ингибитор протеазы, осадок растворяют и фракционируют сульфатом аммония, после чего препарат ингибитора протеаэы очищают и сушат. Отделенный при разде. ленин лизата жмых экстрагируют раствором хлористого натрия, в экстракте коагулируют белки, его фильтруют и затем подкисляют до рН 2,5 соляной кислотой для осаждения гепарина, после че. го гепарин-сырец растворяют, очищают и осаждают 111. Однако известный способ не обеспечивает получение препаратов достаточной чистоты.Целью изобретения является повышение чисто. ты препаратов.Для этого согласно предлагаемому способу лизис животного сырья осуществляют добавлением по крайней мере одного протеолитического фермента, разделением лизата на две фазы путем добавления катионного поверхностно. активного вещества (четвертичного аммонийного основания из группы цетилпиридиния и цетилтриметиламмонийбромида), а извлечение гепарина, как и ингибитора протеазы, осуществляют из жидкой фазы лизата Для получения ингибитора протеазы и гепаринасогласно предлагаемому способу следует использовать в качестве исходного сырья околоушнью желе эы или поджелудочные железы или печень.Протеолитические ферменты, добавляемые для разделения лиэата на две фазы, целесообразно выбирать из группы папаина, фицина и бромалипа.3 Ьзис можно прекращать путем нагревыщя лизата.П р и м е р 1. Измельченное легкое коровы в количестве 10 кг перемешатж с 16 л дистиллированной воды и получили шлам. Массу нагрели до 40 С при перемешивании, а затем в нее добави. ли суспенэию из 20 г папаина, 4 л 0,25 М раствора буферного цитрата при рЯ 5,5 и 200 г сульфата магния, Температуру довели до 55 С, после чего массу выдержали в таких условиях в течение 4 ч, Далее величину рН массы довели до 6,2 добавлением отдельными порциями концентрированнойоаммиачной воды после чего нагрели до 90 С. Затем массу профильтровали под давлением, а остаток сбросили в отход. Прозрачную жРцкость обра ботали цепцширидинием до полной флоккуляции полианионов. С целью отделения гепариносодержащего осадка полученную хощкость профильтровали и в неедобавили дополнительное количество трихлоруксусной кислоты до конечной концентрации 3%. По истечении ЗО мин вновь профильтровали под давлением с промывкой фильтра 4 л З.ной трихлоруксусной кислоты. Таким образом, получили гепарин, содержащий осадок, и 32 л прозрачной жидкости, ингибирующая активность которой была равна 610 и. ед,/см и. едединица ингибировакия), о Указанная активность эквивалента выходу 1,95 10 и.ед./кг исходной массы органа. Далее этот раствор подвергли фракциоиированию с использованием сульфата аммония концентрацией 0,5 - 0,9 путем центрифугирования. Получили 85 г осадка (ингибитора протеазы), содержащего 1,9 10 и,ед.7приблизительно 98% от общей активности, достигаемой в процессе лизиса), Содержание белкового материала было равно 36,5%, что соответствовало степени чистоты 1,56 мкг/и.ед. Последующую 4 О очистку проводили известными методами. В результате получили 465 мл апирогенного раствора активностью 32000 и.ед. см, т.е. всего 1,49 10 и,ед. Это указывает на 76%-ный выход по сравнению с первоначальной активностью. Степень чистоты, как это установили при анализе на белковьй материал, составила 0,143 мкг/и.ед.П р и м е р 2. Процесс, идентичный тому, который описан в примере 1, провели с заменой папаина фицином. Выход иигибитора протеида 5 о был равным 2,03 10 и.ед./кг легкого в состоянии очищенного продукта. П р и м е р 3, Измельченное легкое коровы в количестве 5 кг перемешали с 8 л воды. Затем в шлам добавили 2 л суспензии, содержащей 10 г бромелина в фосфатном 0,1 М буфере при рН, установленном путем поцкисления 1%-ным раствором этилендиаминтетрауксусной кислоты. Эту массу осторожно нагрели до 37 С и при этой температуре выдержали в течение 4 ч. По истечении этого промежутка времени температуру новы.силн до 90 С в течение 10 мин. После этого массу профильтровыш под давлением с промывкойна фильтре 2 л дистиллированной воды. Фильтратохладили и обработали цетилтриметиламмоний.бромидами до полной флоккуляции Полианионов,причем хлопья осадка собрали на фильтре с цельювыделить гепарин, Объем прозрачного фильтратасоставлял 16 л, а его активность была равной540 и.ед./смз, что соответствовало выходу 1,735106 и.ед,/кг исходного органа животного, Дальней.шую очистку ингибитора протеазы осуществилипо аналогии с изложенным в примере 1, Конечныйвыход очищенного продукта был равен 1,18 10 и,ед/кглегкого.П р и м е р 4. 2,5 кг порошкообразногосухого легкого коровы подвергли экстрагированиюпо примеру 1. Конечньй выход ингибитора протеазы составил 3,2 в 10 и,ед./кг порошка,П р и м е р 5. Из 2,5 кг порошкообразного легкого коровы и 23,5 л дистиллированной в.ды приготовили шлам. После осторожного нагревания до 40 С с перемешиванием в него добавилисуспензию из 40 г панкреатина в 4 л 0,2 М буферного раствора триэтаноламина при рН 8, содержа.щего 30 г хлористого кальция. При этой темпера.туре (40 С) смесь выдержали в течение 24 ч,после чего температуру повысили до 90 С, Затеммассу профильтровали под давлением. Фильтратобработмщ по аналогии с изложенным в примере 1. Конечный выход ингибитора протеазы состав.лял 4,2 10 и,ед./кг порошкообраэного легкого всостоянии сырого продукта и 2,8 ф 10 и ед./кглегкого и состоянии очищенного продукта.П р.и м е р б. Из 10 кг легкого коровыи 16 л дважды перегнанной воды приготовили шламПри осторожном нагревании до 40 С в щлам добавили 500 г свежей поджелудочной железы коро.вы, которую предварительно измельчили и приготовили шлам в 4 л 0,2 М буферного триэтаноламинового раствора при величине рН 8, содержащего30 г хлористого кальция.Последующие операции проводили по аналогии с изложенным в примере 5. Конечньй выходингибитора протеазы составил 1,2510 и.ед,/кгоргана животного в состоянии сырого продуктаи 0,780 10 и.ед/кг органа животного в состоянииочищенного продукта.П р и м е р 7. 20 л жидкого экстракталегкого в виде остатка от выделения гепарина чевертичными аммониевыми основаниями подкисли.ли добавлением трихлоруксусной кислоты до копечной ее концентрации 3% По истечении 60 минмассу профильтровали под давлением и промылина фильтре 5 - 10 л 3%-ной трихлоруксусной кислоты. Таким образом получили 23,2 л прозрачнойжидкости, которая содержала 352 и.ед./см,Ълее эту жидкость подвергли фракциониро.ванию высаливанием сульфатом аммония при кон.центрации от 0,45 до 0,9 от концентрации насыще.ния, Таким образом получили 41 г осадка, общая611595 Формула изобретения Составитель М. АндрееваРедактор Л. Новожилова Техред Н. Бабурка Корректор С, й 1 екмарЗаказ 2943/49 Тираж 568 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР ло делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 5активность которого (после сбора осадка центрифугированием) составила 7,9104 и,ед. Содержание белковых веществ 31,5%, что соответствовало удельной активности 1,63 мкг/и.ед.В результате дополнительных операций очист 5 ки, которым подвергли этот осадОк, получили апирогенный раствор, который содержал 36000 и.ед./см . Конечный выход ингибитора протеазы составил 5,7 ф 10 а и.ед. т.е. 70% активности от той полной активности, которой характеризо 10 вался сырой материал. Удельная активность 0,141 мкг(м,ед.Таким образом предлагаемый способ обеспечивает повышение чистоты получаемых препаратов, а также направлен на усовершенствование очистки15 и решение проблемы, связанной с загрязнением окружающей среды, имевшим место при осуществлении процесса получения ингибитора протеазы гепарина по известным способам. 1, Способ одновременного получения ингибитора протеазы и гепарина, предусматривающий осуществление лизиса животного сырья, прекращение лизиса, разделение лизата на фракции, извлечение гепарина, извлечение ингибитора протеазы из жидкой фракции лизата, растворение осадка ингибитора протеазы с последующим его фракционированием путем добавления сульфата аммония, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышениячистоты получаемых препаратов, лизис животногосырья осуществляют добавлением по крайней мереодного протеалитического фермента, разделениелизата на две фазы осуществляют путем добавления катионного поверхностно-активного вещества,а извлечение гепарина, как и ингибитора протеазы,осуществляют иэ жидкой фазы лизата.2. Способ по п.1, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что в качестве исходного животного сырьяиспользуют околоушные железы или поджелудочные железы или печень,3. Способ по п.1, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что протеолитические ферменты выбираютиз грутшы папаина, фицина и бромалина.4, Способ по и 1, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что лиэис прекращают путем нагревания лизата,5. Способ по п.1, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что в качестве катионного поверхностно активного вещества используют четвертичное аммониевоеоснование из группы цетилпиридиния и цетилтриметиламмонийбромипа.Источники информации, принятые во вниманиепри экспертизе:1. Авторское свидетельство СССР Кф 377159,кл. С 07 6 7/02, 1970.