Способ получения адсорбентов, содержащих аминогруппы

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК ОПИС ЗОБРЕТ Я,7 РСНОМ СВИДЕТЕЛЬ В,.щийсния проческихбиопол с- ота с ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(ЭегхчаС 1 гаС 1 оп оГ абрагове апй ро 1 уасгу 1 ашйе Ьеайв), - "Ю, Во 1,СЬеш,"1970, ч,245. с. 3059-3065,2. ВецСвсЬ Э,С., Магог: Е,Т. Р 1 авшподеп:рцгГдсаСоп Ггош Ьцшап р 1 аяша Ьу аГГп 1 Су сЬгошаСо 8 гарЬу,"Зс 1 епсе", 1970, т. 170, с,1095-1096.3, У 1 сЬеЕ М М 1 гоп Т, ЯСаЬ 1 еЬ 18 Ь сарасхСу апй поп сЬагдей а 8 агояе.цегдчаСчев Гог шшоЬ 1 гаСоп оГ .Ьо 1 одса 11 у асСзче сошроцпйв апцГог аХГпхСу сЬгошаСо 8 гарЬу; - Мо 1,пй Се 11, ВосЬеш 1974, т. 4,181-187 (прототип),801054353 А З 5 П С 08 В 37/12; В 01 Ю 20/30; С 12,Б 11/00) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АДСОРБЕНДЕРЖАЩИХ АИИНОГРУППЫ, ковалентсоединением лигандов к активиьаа твердич носителям с последумической модификацией иммобиного лиганда, о т л ич а юя тем, что, с целью упрощецесса и исключения неспецифнэффектов при хроматографииимеров на укаэанных адсорбентах, в качестве лигандов используют гидраэиды И-замещенных аминокислот или пептидов, .а последующую химиче кую модификацию осуществляют обраб кой носителя 3,9-4,1 М раствором хлористого водорода в диоксане или эквимолярной смесью трифторуксусной кислоты и хлористого метилена.Изобретение относится в способамполучения адсорбентов, содержащихаминогруппы, и может быть использовано при очистке биоиолимеров (например, белков) методами гидрофобной илиаффинной хроматографии. 5Известен способ получения адсорбентов, содержащих аминогруппы, путем присоединения лигандов (с,ш-диаминоалканов) к активированным твердым носителям (ВтСИ-активированной 10агарозе) Г 13.К недостаткам способа относитсявозникновение положительно заряженной изомоченинной группы в месте присоединения лиганда к носителю и необ ходимость использования эначительноГо избытка диаминоалкана для предотвращения поперечного связывания шариков агарозы.Известен также способ получения адсорбентов, содержащих аминогруипы, коналентним присоединением лигандов К активированным твердым носителям (иммобилизацией лизина на ВгСБ-активированной агароэе ) ( 2 3.25Однако этот способ вызывает появление на адсорбенте не только дополнительных положительно заряженных групп в месте присоединения лизина к носителю, но и карбоксильных групп, что может придавать адсорбенту нежелательные ионообменные свойства.Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и результатам является способ получения адсорбеитов, содержащих аминогруипы, коналентным присоединением лигандов (дигидразидов двухоснонных кислот ) к, актинированныи твердим носителям (ВтСЛ-активированной анарозе) с последующей химической модификацией 4 О иммобилизонанного лиганда (сукцинилирование и присоединение с,м-диаминоалканон с помощью карбодиимидов). Полученные адсорбенты при Физиологических значениях рН не содержат заряженных групп н месте присоединения лиганда к носителю (.3 3.Однако этот способ отличается многостадийностью и необходимостью использования большого избытка дигидраэидов и дефицитных карбодиимидов. Кроме того, полученные адсорбенты могут содержать непрореагировавшие с диаминоалканом карбоксильные группы, что приводит к появлению дополнительных заряженных групп 5 и наличию неспецифических эффектов ири хроматографии биополимерон.Цель изобретения - упрощение процесса и исключение неспецифических эффектон при хроматографии биополи мерон на указанных адсорбентах.Укаэанная цель достигается тем, что согласно способу получения адсорбентов, содержащих аминогруипы, ковалентным присоединением лигандов 65 к активированным твердым носителямс последующей химической модификацией иммобилизованного лиганда вкачестве лигандов используют гидразиды И-эамещенных аминокислот илипептидов, а последующую химическуюмодификацию осуществляют обработкой носителя 3,9-4,1 М растворомхлористого водорода в диоксане илиэквимолярной смесью трифторуксуснойкислоты и хлористого метилена,Использование предлагаемого способа получения адсорбентон, содержащих аминогруипы, позволяет получать адсорбенты,не имеющие дополнительных заряженных групп, что исключает нежелательные ионообменныеэффекты ири последующей хроматограФии, Полученные адсорбенты могутбыть использованы для очистки биополимеров, например, протеолитических Ферментов, моно- и диаминоксидаз. В последнем "лучае в качестве лиганда целесообразно использовать произнодные лизина, что приводит к адсорбенту с иммобилизованным 1,5-диаминопентаном - биоспециФическим лигандом для диаминоксидазы. Кроме того, при использованиипроизводных лизина существенно увеличивается удельное содержаниеаминогрупп на адсорбенте.Адсорбенты,полученные по предлагаемому способу, могут служить вкачестве исходного материала дляпоследующего присоединения биоспецифических лигандов различной химической природы по аминогруппам иммобилиэонанных аминокислот или пептидов, В последнем случае открывается возможность получения высокоэффективных аффинных адсорбентов с незаряженными гидрофильными пептиднымивставками.В качестве носителей могут бытьиспользованы различные твердые носители, устойчивые н условиях удаления И-защитных групп, такие какСЬ-сефароэа, полиакриламидные носители, шарики из пористого стекла идругие, В качестве лигандов применяют гидразиды Л-замещенных Ы-, м - ,диаминокислот и т,д, Предлагаемыйспособ позволяет использовать в качестве защитных групп лиганда третбутилоксикарбоыильную, тритильную,трифторацетильную и другие защитныегруппы, удаление которых можно осуществить в условиях, не разрушающих адсорбент,П р и м е р 1, Получение адсорбента Ь-лизин-гидразид-СЬ-сефароэа.Суспензию 10 мл ВгСИ-активированной СЬ-сефароэы в 10 мл 0,1 М раствора БаНСО, рН 0,0,перемешивают20 ч ири 4 ОС с 50 мг (0,1 ммоль)гидразида Л ,Б -ди-трет-бутилоксикарбонил (БОК)-Ь-лизина, промывают(мкэкв/г вл.веса)= Количество БН -групп24,65 А 420 нмколичество сефарозы г вл.веса/100 мл сус- пензии Условия снятия БОК-защитных групп Оптимальное время гид- ролиэа Максимальное коли чество БН 2-групп, мкэкв/г вл.веса 40 85-ная НСООН 23 1,5 85-ная НСООН-СН 2 С 1 (1:1) СРзСООН-СН 2 С 12 (1;1) 1,245 3,9 23 СР соон-сн с 12(1:2) 4,2 50 4 М НС 1 в диоксане 3 5,4 0,5 Ог 1 М НС 1 в АсОН 23 55 65 100 мл 0,1 г( Бг.НСОЗ, водой, затем50 мл смеси уксусная кислота - вода(1:1) и окончательно водой. Полученный гель смешивают с 10 мл 1 Иэтаноламина, рН 9,0,перемешиваюто2 ч при 20 С и промывают водойСогласно данным потенциометрическоготитрования адсорбент не содержитположительно заряженных групп прифизиологических значениях рН.10 мл адсорбента (Б, Б-ди-БОК-Ь-лизин гидразид-СЬ-сефароза)промывают 200 мл ацетона, затем100 мл хлористого метилена (илидиоксана),обрабатывают 5 ч при40 С 10 мл смеси трифторуксуснойкислоты и хлористого ь тилена илио3 ч при 4 С диоксаном, насыщенньмНС 1 (4 М), затем промывают хлористым метиленом (или диоксаном),спиртом, водньм спиртом и окончательно водой.Результаты использования различных условий снятия БОК-защитныхгрупп приведены в таблице,Адсбрбент Ь-лизин-гидразид-СЬ-сефароза хранят в воде в присутствии 0,02 аэида натрия при 4 гС. П р и м ер 2. Получение адсорбента Ь-лизин-гидраэидглутаральдегид-биогель Р Перемешивают 20 мл биогеля Рс 100 мл 6-ного раствора глутарового альдегида в 0,1 И калий-фосфатном буферном растворе, рН 7,0, в течение 17 ч при 37 С, гель промывают водой, смешивают с раствором 60 мг Определение содержания лиганда в полученном адсорбенте проводят спектрофотометрическим глетодом в геле - по поглощению в Уф-свете суспензии .ринитрофенилированных производных аминосодержащих адсорбентов в 0,1-ном растворе агарозы. Аликвоту адсорбента перемешивают 2 ч при 37 С с 1,5 мл 0,1-ного 1 О водного раствора тринитробенэолсульфокислоты, содержащего 0,1 БаНЯО 3,в 3 мл 2 М калий-боратного буферного раствора, рН 9,2, фильтруют,гель тщательно промывают водой, вы держивают на пористом фильтре в течение 3 мин в вакууме водоструйногонасоса, Навеску полученного тринитрофенилированного производного сефарозы (0,15 - 0,9 г влажного веса)переносят в кювету, содержащую 1,5 мл0,1 -ного раствора агарозы в 1,5 мл1 М калийборатного буферного раствора и измеряют поглощение суспензиипри 240 нмротив аналогичной суспензии незамещенной сефарозы. Количество БН -групп определяют по форгидраэида Б ,Б -ди-БОК-Ь-лизина в 30 мл 0,1 М калий-фосфатного буферного раствора, рН 7,0, перемешивают 2 ч при 4 С, промывают водой, затем 50 мл 0,1 И раствора НС 1 и водой,20 мл полученного адсорбента про мывают 200 мл ацетона, 100 мл хлористого метилена, затем смешивают с 20 мл смеси трифторуксусной кисло ты.и хлористого метилена и перемешивают 16 ч при 4 С, затем промывают хлористым метиленом, спиртом, водным спиртом и окончательно водой, Адсорбент Ь-лизин-гидраэид-глутаральдегидбиогель Рпо данньы спектрофотометрического анализа в геле содержит 1,3(мкмоль Ь-лизина на 1 г влажного веса. П р и м е р 3. Получение адсорбента аминокапроилгидразид-СЬ-сефароэа. Суспензию 10 ип ВгсБ-активированной СЬ-сефарозы в 10 гоп О, 1 М раствора Банс 03,рн 8,0,перемешивают 16 чпри 4 Сс раствором 100 мг (0,2 ммоль) оксалата гидразида Б-тритил-Г-аминокапроновой кислоты в 10 мл воды, промывают 100 мл 50-ного диметилформамида, 100 ил воды. Полученный гель смешивают с 10 мл 1 М этаноламина,1054353 Составитель И. СтояченкоРедактор Н, Киштулинец Техред О,Неце Корректор Г. Огар Заказ 9031/30 Тираж 494 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб д, 4/5 Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул, Проектная, 4 рН 9,0, перемешивают 2 ч при 20 Си промывают водой.10 мл полученного адсорбента промывают 200 мл ацетона, затем 100 млдиоксана, обрабатывают 2 ч (4 С) 4 Мраствором хлористого водорода в диск-сане, промывают диоксаном, спиртом,водными спиртами и окончательно водой.Адсорбент по данным спектрофотометрического анализа в геле содержит1,7 мкэкв БН 2-групп на 1 г влажноговеса.Таким образом, предлагаемый споСоб является более простьм, чем известный, н исключает неспецифическиеэффекты при хроматографии биополимеров на полученных сорбентах,Предлагаемый способ также позволяет повысить удельное содержаниеаминогрупп на адсорбенте (так, вслучае использования Б,Б-защищенных рОпроизводных гидразида лизина количество аминогрупп на моль иммобилиованного лиганда увеличивается вдвоео сравнению с (.3 3 или лигандами,содержащими 1 аминогруппу), Увеличение концентрации аминогрупп позволяет при дальнейшем присоединении биоспецифического лиганда существенно повысить концентрацию последнего на адсорбенте, что в ряде случаев может оказать положительный эффект на последующую хроматографическую очистку биополимеров.Предлагаемый способ исключает также наличие Гидрофобных групп на адсорбенте по сравнению с 3 3, что также исключает неспецифические эффекты при хроматографии биополимеров,Базовым объектом можно считать аминогексилсефарозу (АН-ЯеРЬагове) - продукт шведской фирмыРЬагшас 1 е Р 1 пе Сйешса 1 а, который широко используется в исследовательской работе.Указанный коммерческий продукт производится иммобилизацией гексаметилендиамина на БгСМ-активированной сефарозе. Он содержит дополнительную положительно заряженную группу в месте присоединения лиганда к носителю, а также гидрофобную гексаметиленовую углеводородную цепочку. Предлагаемые адсорбенты не содержат гидрофобных и дополнительных заряженных групп.