Способ получения -сульфоната в-цепи инсулина человека

(23) ПриоритетОпубликовано 05.10Дата опубликовани сударстоениыи ком Совета Министров СССРло делам изобретенийи открытий 547.964.4.071) Заявитель Л расного Знаменианова дена Трудопет цм. А,дена Ленина и орственный унцве 54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 8 - Я-СУЛЪФОНАТА В-ЦЕПИ ИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА2 шенствовачеловека,Изобретение относится к усовернию способа получения инсулинаприменяемого в медицине.Известен способ получения 5 - 5-сульфоната В-цепи инсулина человека путем конденсации низших пептидов, например защищенного пептида В 1 9, с защищенным пептидом В 1 з 0 известным методом, удаления защитных групп окислительцым сульфитолизом и выделения целевого продукта известным способом.К недостаткам известного способа относятся сложность процесса и довольно низкий выход целевого продукта.С целью упрощения технологии процесса и повышения выхода целевого продукта предлагается защищенный пептид последовательности 1 - 8 конденсировать с защищенным пептидом последовательности 9 - 14 методом смешанных ангидридов, полученный защищенный пептид последовательности 1 - 14 превращать в гидразид обработкой трифторуксусной кислотой; защищенный пептид последовательности 15 - 20 конденсировать с защищенным цептидом последовательности 21 - 30 методом активированных эфиров, с полученного защищенного пептида последовательности 15 - 30 удалять М-конечную защитную группу ацидолизом; гидразид пептида последовательности 1 - 14 конденсировать азидным методом с защищенным пептидом последовательности 15 -30 и с полученного защищенного пептцда последовательности 1 - 30 удалять защитныегруппы действием бромцстого водорода в трцфторуксусной кислоте,5 П р и м е р 1. Бцс-(карбобензокси-фенцлаланцл-валцл-аспарагинцл-глутамцнцл - гпстидцллейцил) -ццстинил-бцс- (глицпл-О-трет - бутцловый эфир-серил-гцстидпл-лейццл-валил)-1 трет-бутиловый эфир-глутамцл-алаццл-трет 10 бутилоксикарбонил-гидразцд.0,120 г карбобепзокси-О-трет-бутиловьшэфир-серцл-гистидил - лейцил-валил-у - третбутиловый эфир-глутамил-аланпл-трет-бутилоксикарбонпл-гидразцда суспендируют в 5 мл15 метанола и гидрируют в присутствии палладия на угле в течение двух дней, Катализаторотфильтровывают, промывают на фильтре водой и метанолом, фцльтрат упарцвают досуха,растворяют остаток в 2 мл гексаметапола, до 20 бавляют к раствору. 0,120 г бцс-(карбобецзок.си-фсццлалаццл-валил-аспараг п 1 п,1 - глтамцццл-гцстидцл-лейцил) -ццстшпцл-бцс-глцццна0,031 г дцццклогексплкарбодццмида, выдерживают два дня прн 0 С ц два дня прц ком 25 цат пой температуре. Отфцльгровывают дцццклогексцлмочсвцну, разбавляют фцльтрат эфиром, отфильт 1 ов 1 явают выпавший осадок, промывают его на фильтре смесью метанол -эфир, сушат и получают 0,125 г продукта, со 30 держащего 1,2 (1) цистеина, 1,8 (2) гистидн 48706660 65 на, 0,7 (1) аспарагиновой кислоты, 0,4 (1)серина, 1,0 (1) глиципа, 1,5 (2) глутаминовойкислоты, 1,7 (2) валипа, 0,6 (1) фенилаланииа, 1,8 (2) лейцина, 0,7 (1) аланипа,Здесь н далее в скооках указано теоретическое количество аминокислот,П р и и е р 2. Бис-(о-нитрофенилсульфениллейцил-тирозил-лейцил-валил) -цистинил - бис(глицил-у-трет-бутиловый эфир-глутамил-аргинил-глицил - фенилаланил-фенилаланил-тирозил-треонил-пролил - в-трет-бутилоксикарбонил-лизил-треонин).К раствору 1,0 г бис-(о-нитрофенилсульфенил-лейцил - тирозил-лейцил-валил)-цистинилбпс-глицина и 0,2 г и-нитрофенола в 15 млДМФЛ при - 10 С добавляют 0,3 г дициклогексилкарбодиимида, оставляют на ночь при0 С, отфилыровывают дициклогсксилмочевину, разбавляют фильтрат водой, экстрагируютэтилацетатом, сушат и упаривают экстрактдосуха. После кристаллизации остатка изсмеси изопропиловый спирт - гексан получают0,6 г (50%) продукта, т. пл. 270 С (разл.);ао = - 22 О (с=1, ДМФА),Найдено, /о. С 54,39; Н 6,73СвбН 1 ои 1 ыОм 84Вычислено, %: С 54,39; Н 6,00.0,9 г карбобензокси-у-трет-бутиловь й эфирглутамил-аргинил - глицил-фенилаланил - фенилаланил-тирозил - треонил - пролил-в-третбутилоксикарбонил-лизил-треонина растворяют в 10 мл метанола, добавляют 5,36 мл0,10 н. серной кислоты и гидрируют в присутствии палладия на угле в течение трех дней.Катализатор отфильтровывают, упариваютрильтрат досуха, растворяют остаток в50%-ном метаноле и обрабатывают ионообменной смолой Лмберлит ИРА(ОН - -форма). Смолу отфильтровывают, промывают нафильтре 50%-ным метанолом, упариваютфильтрат досуха, сушат остаток в вакууменад пятиокисью фосфора и растворяют в 4 млДМФЛ. К полученному раствору добавляют0,4 г продукта, полученного выше, выдерживают один день при комнатной температуре,разбавляют эфиром, отделяют осадок центрифугированием, кристаллизуют из метанола иполучают 0,7 г (77%) продукта, т. пл, 174 -178 С; а = - 26 (с= 1, ДМФА) .Найдено, %: С 56,89; Н 7,33.СлФгюо 40 ы 842 НО,Вычислено, о/О. С 56,92; Н 6,85. Лминокпслотный состав: цистеин 1,1 (1), лизин 0,9 (1), аргинин 0,6 (1), глицин 1,7 (2), глутаминовая кислота 1,0 (1), тирозин 1,0 (2), лейцин 2,7 (2), фенилаланин и валин 3,5 (3), треонин 1,9 (2).П р и м е р 3. Я,Я-Дисульфонат В-цепи, 50 мг продукта, полученного в примере 1, растворяют в 10 мл трифторуксусной кислоты, выдерживают 1 час при комнатной температуре, упаривают досуха, разбавляют остаток водой и снова упаривают досуха. Эту операцию повторяют еще три раза. Остаток после 10 15 20 25 30 З 5 40 45 50 55 упарнванпя растворяют в 10 мл ДМФЛ, до. оагляют 0,07 мл 2,00 н. раствора НС 1 в тетрагидрофуране, при - 20 С добавляют 0,1 мл раствора, содержащего 1,9 мг нитрита натрия, выдерживают 30 мин при - 20 С, охлаждаютолуче;шый азид до - 40 С и нейтрализуют триэтп;:амином.62 мг продукта, полученного в примере 2, растворяют з 5 мл метанола, охлаждают до 0 С и добавляют 0,1 мл уксусной кислоты и 0,1 мл 0,3 и, раствора НС 1 в метаноле. Через 10 мин смесь упаривают досуха, растворяют остаток в воде и обрабатывают ионообменной смолой Лмберлит ИРА(ОН - -форма), Смолу отфильтровывают, промывают на фильтре водой, упаривают фильтрат досуха, растворяют остаток в минимальном количестве ДМФА и при - 40 С добавляют к раствору, содержащему азид. Полученную смесь выдерживают три дня при - 5 С и два дня при комнатной температуре, упаривают досуха, осзаток растворяют в 30 мл трифторуксусной кислоты и в течение 2 час пропускают через раствор сухой бромистый водород. Раствор упаривают досуха при комнатной температуре, сушат остаток в вакууме над твердой щелочью и пятиокисью фосфора, растворяют в 10 мл дпоксана и 6 мл 0,2 н, трис-буфера (рН 8,1), К полученному раствору добавляют 110 мг сульфита натрия и 60 мг тетратионата натрия, выдерживают 12 час при комнатной температуре и 2 час при 37 С, диализуют 6 час против нескольких смен дистиллированной воды, раствор после диализа упаривают до небольшого объема и лиофилизуют, Получают 12 мг (13 О/о) продукта, а = - 95+5 (с=-0,1, 0,5 н, уксусная кислота),Лминокислотный анализ: лизин 1,15 (1), гнстидин 1,92 (2), аргинин 0,92 (1), аспарагиновая кислота 1,05 (1), треонин 1,94 (2), серии 0,97 (1), глутаминовая кислота 3,18 (3), пролин 1,10 (1), глицин 3,0 (3), алании 1,0 (1), цистеин 1,59 (2), валин 2,85 (3), лейцин 3,77 (4), тирозин 1,85 (2), фенилаланин 2,72 (3). Электрофорез проводят на бумаге при напряжении 1000 - 1200 в и экспозиции 50 - 60 мин в 2,о-ной уксусной кислоте, проявляя бензидинсм и хлором, и в буферном растворе, содержащем 4 М мочевину, муравьиную кислоту и уксусную кислоту (13: 3: 2), проявляя реактивом Паули. Во всех случаях продукт был индивидуальным, его подвижность совпадала с подвижностью бис-сульфоната В-цепи инсулина быка, выделенного из природного инсулина и использованного в качестве свидетеля,Предмет изобретенияСпособ получения 8 - 8-сульфоната В-цепи инсулина человека конденсацией низших пептидов известным методом с последующим удалением защитных групп окислительным сульфитолизом и выделением целевого продукта известным способом, отличающийся тем, что, с целью упрощения технологии процесса487066 Составитель Л. фонина Текред Т. Миронова корректор А. Дзесова 1 зедактор Т. Шарганова Заказ 1027/9 Изд.56 Тираж 529 Подписное ЦНИИПИ Государственного когиитета Совета Министров СССР по деда:а изобретений и открытий 13035, Москва, Ж, 1 заушская иао., д. 4/5Типография, пр. Сапунова, 2 и повышения выхода целевого продукта, защищенный пептид последовательности 1 - 8 конденсируют с защищенным пептидом последовательности 9 - 14 методом смешанных ангидридов и полученный защищенный пептид последовательности 1 - 14 превращают в гидразнд обработкой трифторуксусной кислотой; защищенный пептид последовательности 15 - 20 конденсируют с защищенным пептидом последовательности 21 - 30 методом активироБ;1 пых з(1)11)ОВ 11 с полус 1110 ГО защищенного пентида последовательности 15 - 30 удаляют М-конечную защитную группу ацидолизом; гидразид пептида последовательности 1 - 14 5 конденсируют азидным методом с защищенным пептндом последовательности 15 - 30 и с полученного защищенного пептида последовательности 1 - 30 удаляют защитные группы действием бромистого водорода в трифторук сусной кислоте.