Способ получения пенициллинацилазы

(33) ФРГ Государственный комитет Совета Министров СССР 3) УДК 615.779,9,74. Бюллетень М публикован ло делам изобретений и открытийта опубликования описания 24.09.75 72) Автор изобрете Иностранец Карл Кутцбах(ФРГ) остранная фирма Байер АГя(54) СПОСОБ ПОЛ Изобретение относится к фармацевтическойпромышленности.Известен способ получения пеницилазы, заключающийся в том, что клетразрушают, высаливают целевой прсырого экстракта сульфатом аммониматографируют па карбоксиметилцелдиэтиламиноэтилцеллюлозе, Однако выходцелевого продукта невысок.Целью изобретения является увеличениехода целевого продукта и повышение его кчества,Для этого рН экстракта доводят дотделяют осадок и хроматографируликатах алюминия, например на бенкристаллизуют целевой продукт ввии сульфата аммония. ллинацики Е.со 11 одукт из я и хролюлозе и выао 3,5 - 5,5, ют ца ситоите, и прис тстЕ, со 11 выращивают рифугируют до гус 3%-цый метилизоо 7,5, размешивают ют сырой экстракт, до рН 5,0 и ценразовавшегося проед специфическая авляют ионообмен), обессоливают Пример 1, Культуруизвестным способом, центтой суспензии, добавляютбутилкетоц, доводят рН днесколько часов и получа90 г которого подкисляюттрифугируют. К 80 л обзрачного раствора (62000активность 0,25 ед/мг) добник (1 ега 11М 600 и Ь ИЯ ПЕНИЦИЛЛИНАЦИЛАЗЪ до 1,5, отфильтровывают ионообмеццик, доводят рН до 5,0, добавляют 350 г бентонпта, размешивают 30 мин, отделяют бецтонит в центрифуге, вымывают его 5 л 0,5 М натрийфос фатного буфера при рН 8,0, фильтруют и получают 5,2 л элюата 140000 ед, (65%), специфическая активность 1,45 ед/мг.Часть элюата (9000 ед) обессоливают фильтрацией па геле, доводят рН до 5,0 и подают 10 на колонку, заполненную сефадексом 8 Е, обработанным 0,05 М ацетатом натрия (рН 5,0), В качестве элюецта используют 4 л 0,07 М и 0,25 М ацетат натрия (рН 5,0). К объединенным активным фракциям 18100 ед. (90%) 15 добавляют сульфат аммония до 70%-ного насыщения. К концентрированному раствору энзима (специфическая активность 5,8 ед/мг) добавляют насыщенный раствор сульфата аммония до - 50%-цого насыщения, центрифу гируют и выдерживают несколько дней при40 С, наблюдая кристаллизацию.Пример 2. 60 л переведенного в растворимую форму сырого экстракта центрифугируют при рН 5,0, отделяют прозрачный рас твор (92000 ед, специфическая активность0,45 ед/мг), обессоливают ионообмецником, при рН 5,0 добавляют 150 г бентоцпта, отделяют его центрифугированием, добавляют еще55 60 65 3200 г бентонита, отделяют аналогичным образом и вымывают 5 л 1 М ацетата натрия при рН 8,0. Элюат 51000 ед. (53/о), специфическая активность 1,8 ед/мг обессоливают фильтрацией на геле и после хроматографирования на сефадексе ЬЕ получают раствор чистых энзимов, который концентрируют, смешивают с насыщенным раствором сульфата аммония и кристаллизуют пенициллинацилазу, как в примере 1.П р и м е р 3, Переведенный в растворимую форму сырой экстракт, полученный из 2900 л культуры Е.со 11, центрифугируют при рН 5,0, 256 л чистого раствора (150000 ед специфическая активность 0,32 ед/мг) разбавляют водой до 920 л, добавляют 1,кг бентонита, размешивают 1 час, отделяют центрифугированием. Вымывают 0,5 М ацетатом натрия при рН 8,0 и получают 6,9 л раствора (62000 ед., специфическая активность 1,2 ед/мг). Вторым промыванием бентонита 0,5 М фосфатом натрия получают 9,8000 ед, Общий выход 47%. Элюат (47000 ед,) обессоливают фильтрацией на геле, доводят рН до 5,0 и подают -400 мл влажного сефадекса 5 Е, обработанного 0,05 М ацетатом натрия (рН 5,0), адсорбируют сефадекс ЬЕ, гель отфильтровывают и вводят в колонку диаметром 5 см, содержащую 1600 мл свежего сефадекса ЬЕ в 0,05 М ацетата натрия (рН 5,0). Затем вымывают линейным градиентом из 4 л 0,07 М и 4 л 0,25 М ацетата натрия, рН 5,0. Соединенные активные фракции содержат 36000 ед. чистого энзима со специфической активностью 5,3 ед/,мг.Раствор чистого энзима концентрируют и осторожно добавляют твердый сульфат аммония до наступления легкого помутнения, Кристаллизация происходит при 4"С через несколько дней. П р и м ер 4. Сырой экстракт из клеток Е. со 11 концентрируют центрифугированием в густую суспензию и клетки известными способами, а в случае необходимости добавлением 3%-ного метилизобутилкетона переводят в растворимую форму.610 л сырого экстракта (1,3 10 ед.) разбавляют деионизированной водой до 2100 л, доводят значение рН до 5,0 серной кислотой, центрифугируют и получают прозрачный раствор (1,42 10 ед., специфическая активность 0,42 ед/мг). При рН 5,0 добавляют 13,8 кг бензонита и через 30 мин отделяют в проточной центрифуге. Отделенный бентонит вымывают 90 л 0,5 М раствора ацетата натрия, доводя рН до 8,0, отфильтровывают, получая 92,5 л раствора 1,12 10 ед. (86/о), специфическая активность 1,64 ед/мг.1 л элюата диализируют в присутствии 0,001 М калийфосфатного буфера при рН 7,0.Раствор энзима (8250 ед., специфическая активность 1,8 ед/мг) пропускают через колонку, элюируют 2 л 0,01 М и 2 л 0,1 М бу 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 4фера при рН 7,0, собирая фракции по 25 мл. Пенициллинацилаза содержится во фракциях 110 - 170 С 1,2 л, 6760 ед. (82/О), специфическая активность 6 ед/мг 1.Раствор осаждают твердым сульфатом аммония (472 г/л), осадок отделяют центрифугированием и растворяют в воде, Часть раствора (4700 ед.) разбавляют сульфатом аммония до 46% -ного насыщения, отделяют центрифугированием до прозрачности и сохраняют при комнатной температуре. В течение недели выпадают кристаллы, их центрифугируют, растворяют в 0,01 М фосфорного буфера и диализируют с тем же буфером 3300 ед. (70%), специфическая активность 12,45 ед/мг 1.П р и м е р 5. 60 л переведенного в растворимую форму сырого экстракта доводят до рН 5,0 и центрифугируют.К отстоявшемуся прозрачному раствору (155000 ед., специфическая активность 0,3 ед/мг) добавляют ионообменник и обессоливают. В этот раствор при рН 5,0 добавляют сначала 200 г бентонита, отделяют центрифугированием и выбрасывают, затем добавляют еще 800 г бентонита, центрифугируют и вымывают 20 л 0,5 М ацетата натрия (рН 8,0).Раствор энзима (110000 ед., специфическая активность 1,5 ед/мг) диализируют в присутствии 0,5 М натрийацетатного буфера, доводят рН до 5,0 и подают на колонку, заполненную сефадексом БЕС, обработанным 0,5 М ацетатом натрия (рН 5,0). В качестве элюента используют 15 л 0,07 М и 15 л 0,25 М ацетата натрия, (рН 5,0). Активные фракции 88000 ед. (80%), специфическая активность 4,2 ед/мг 1 (29000 ед.) этого раствора диализируют в присутствии 0,01 М калийфосфатного буфера (рН 7,0) и подают на колонку с сефадексом Ав 0,01 М фосфата калия, рН 7,0. В качестве элюента используют 0,01 - 0,1 М фосфата калия (рН 7,0), затем вымывают пенициллинацилазу 21000 ед. (3%), 11,2 ед/мг специфическая активность 1. Часть раствора (6000 ед.) доводят твердым сульфатом аммония до - 45%-ного насыщения. Через две недели на стенках сосуда образуются большие кристаллы, Еще через две недели при комнатной температуре кристаллы отделяют на центрифуге и небольшое количество растворяют в воде 4260 ед. (71 О/о), специфическая активность 13,1 ед/мг 1. П р и м е р 6. Элюат бентонита, полученный как в примере 4 (4100 ед., 2,0 ед/мг) диализируют в присутствии 0,05 М ацетата натрия (рН 5,0) и подают на колонку с 1.еиаИ ЯР - 100 - Яа+.В качестве элюента используют 0,05 - 0,5 М ацетата натрия, (рН 5,0). Активные фракции 2020 ед. (56% ), специфическая активность 6,6 ед/мг энзима доводят с едким натром до рН 6,5, насыщают твердым сульфатом аммония до 48/о и кристаллизуют чистый энзим 1250 ед. (62/о), специфическая активность 12,1 ед/мг,451249 Предмет изобретения Составитель Т. Головина Техред А, ДроздоваКорректор Л, Орлова Редактор Д, Пинчук Заказ 2144/16 Изд,660 Тираж 506 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5типография, пр. Сапунова, 2 Способ получения пенициллинацилазы путем разрушения клеток Е. со 11, выделения целевого продукта из сырого экстракта и очистки хроматографическими методами, отличающийся тем, что, с целью повышения 6выхода и качества целевого продукта рН экстракта доводят до 3,5 - 5,5, отделяют осадок, хроматографируют на силикатах алюминия, например на бентоните, и кристаллизуют 5 целевой продукт в присутствии сульфата аммония.