Способ получения 6-аминопенициллановой кислоты

.11.74, Бюллетень4ния описания 20,08.75 Госудврствеииын ко Совета Уииистров по делам изобрет те 53) УДК 547.789.61.07(088,8) и открыт ата опублик 2) Автор изобрете Иностранецфриц Хюпер(ФРГ) 1) Заявител остранная фирма Байер АГ (ФРГ) ЧЕНИЯ 6-АМИНОПЕ КИСЛОТЫ ЛАНОВО 54) СПОСОБ Предлагается улучшенный способ получения 6-аминопенициллановой кислоты путем ферментативного расщепления пенициллинов. Она находит применение в синтезе полусинтетических пенициллинов.Известно применение для получения 6-аминопенициллановой кислоты пенициллинацила зы, ковалентно связанной с различными носителями. Однако такие комплексы фермента с носителями сохраняют лишь 50% исходной активности пенициллинацилазы.С целью повышения качества и выхода целевого продукта, предлагается способ получения 6-аминопенициллановой кислоты путем ферментативного расщепления пенициллинов с использованием водонерастворимой пенициллинацилазы, фиксированной на носителе, отличающийся тем, что раствор пенициллина при рН 6 - 8 и 20 - 50 С в течение 3 - 20 час приводят в контакт с суспензией пенициллинацилазы, ковалентно связанной с носителем в виде смешанного полимеризата из акриламида, тч,1 ч-метиленбисакриламида и ангидрида малеиновой кислоты, затем смесь нейтрализуют органическими аминами и выделяют 6-аминопенициллановую кислоту известными способами. В качестве пенициллина используют бензилпенициллин, в качестве органического амина - триэтиламин. Расщепление пениллинов связаннои носителем пенициллинацилазой может быть проведено в производственном масштабе. Нерастворимый фермент суспендируют в растворе 75000 - 150000 Е/мл пенициллина, например калиевой соли бензилпенициллина, Ферментативное расщепление проводят при постоянном значении рН (6 - 8). Для нейтрализации отщепленной фенилуксусной кислоты применя ют водный раствор едкой щелочи, напримерраствор едкого калия или натрия, или органические амины, предпочтительно триэтиламин. С триэтиламином, например, сохраняется активность нерастворимого энзима даже 15 после нескольких раз применения.Ферментативное расщепление проводятпредпочтительно при рН 7,8. При значении рН выше 8,0 пенициллин или 6-аминопенициллановая кислота могут быть разрушены в ре зультате раскрытия кольца р-лактама. Применьших значениях рН равновесие сдвигается в сторону исходного продукта пенициллина, так что расщепление остается не полным, Предпочтительно работать при рН 7,8. Выгод но начинать расщепление при более низкомзначении рН и к концу реакции медленно повышать рН до 7,8.Скорость протекания реакции зависит отприменяемого связанного носителем ферменВыход, % Расщепление 2 3 4 6 7 8 9 10 87,8 86,3 882 8,5 86,9 88,1 87,5 85,0 86,5 та, Например, при использовании раствора бензилпенициллина с концентрацией 100000 Е/мл калиевой соли бензилпенициллина по прошествии 12 час при рН 7,8 и при температуре 38 С наблюдают полный гидролиз до 6-аминопенициллановой кислоты и фенилуксусной кислоты, если на единицу пенициллинацилазы берут 10 единиц бензилпенициллина. Одну единицу фермента (Е) дефинируют как активность, которая при 37 С гидролизует в минуту 1 мкмоль бензилпенициллина. Если на единицу пенициллинацилазы берут 5 К 10" единиц бензилпенициллина, то полное расщепление продолжается 6 час. При более высоких концентрациях фермента возможно также более короткое протекание реакции. Соответственно расщепление продолжается тем дольше, чем меньше применяют фермента. Сроки расщепления более чем 20 час приводят, однако, вследствие разрушения пенициллина и/или 6-аминопенициллановой кислоты к уменьшению выхода.Температура реакции ферментативного расщепления составляет предпочтительно 38 С, При более низких температурах активность фермента уменьшается. Если расщепление проводят, например, при 25 С нужно применять количество фермента в два раза больше, чем при 38 С, для достижения одинаковой продолжительности реакции.Активность нерастворимых, связанных носителем пенициллинацилаз заметно уменьшается в растворах с более высокой концентрацией субстрата. Расщепление раствора с 75000 Е/мл бензилпенициллина продолжается 12 час и с 150000 Е/мл 15 час, если изменяют только концентрацию, но не соотношение фермента и бензилпенициллина. Предпочтительно применять раствор с 75000 - 100000 Е/мл бензилпенициллина.6-Аминопенициллановая кислота может быть легко выделена при применении предлагаемого препарата фермента, Доля связанной носителем пенициллинацилазы в количестве 0,05 вес. % так незначительна, что на носителе едва может быть абсорбирована 6-аминопенициллановая кислота. Связанная носителем пенициллинацилаза после расщепления может быть отделена центрифугированием или фильтрацией и многократно применена для дальнейшего расщепления.Образовавшуюся при ферментативном расщеплении 6-аминопенициллановую кислоту получают в кристаллическом виде из реакционного раствора, который отделяют от нерастворимого фермента и затем концентрируют в вакууме посредством осаждения в изоэлектрической точке при значении рН 4,3.П р и м е р 1. Получение 6-аминопенициллановой кислоты (6-АРЯ) .57 г влажной, связанной носителем пенициллинацилазы (удельная активность 0,044 Е/мг) и 160 калиевой соли бензилпенициллина вводят одно за другим в 2500 мл воды и размешивают при 38 С. Смесь поддерживают посто 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4янно при значении рН 7,8, добавляя триэтиламин. По истечении 12 час не происходит больше поглощения триэтиламина,Связанный носителем фермент отфильтровывают, промывают каждый раз 100 мл воды и 100 мл 0,2 М раствора поваренной соли и применяют снова для дальнейшего расщепления. Фильтрат, включая промывную воду, сгущают в вакууме до объема 300 мл и осаждают 6-аминопенициллановую кислоту в изоэлектрической точке при значении рН 4,3 в присутствии 500 мл метилизобутилкетона. По прошествии 3 час при 5 С отфильтровывают и промывают 200 мл воды и 200 мл ацетона. Продукт высушивают в вакууме при 40 С, т. пл. 208 С, выход 88,3% от теоретического.Связанную носителем пенициллин ацил азу последовательно, как описано выше, применяют десять раз для ферментативного расщепления бензилпенициллина. Получают выходы, приведенные в таблице. Средний выход 87,2%.П р и м е р 2. 110 г влажной, связанной носителем пенициллинацилазы (удельная активность 0,044 Е/мг) описанным в примере 1 образом размешивают с 160 г калиевой соли - бензилпенициллина в 2500 мл воды в течение 6 час при 38 С и при рН = 7,8. Выход 6-аминопенициллановой кислоты составляет 89,5% от теоретического.П р и м е р 3. 30 г влажной, связанной носителем пенициллинацилазы (удельная активность 0,044 Е/мг) описанным в примере 1 образом в течение 20 час при 38 С и рН 7,8 размешивают с 160 г калиевой соли бензилпенициллина в 2500 мл воды. Выход 6-аминопенициллановой кислоты составляет 86,1% от теоретического. Предмет изобретения 1. Способ получения 6-аминопенициллановой кислоты путем ферментативного расщепления пенициллинов с использованием водонерастворимой пенициллинацилазы, фиксированной на носителе, отличающийся тем, что, с целью повышения качества и выхода целевого продукта, раствор пенициллина при рН 6 - 8 и температуре 20 - 50 С в течение 3 - 20 час приводят в контакт с суспензией пенициллинацилазы, ковалентно связанной с носителем в451248 Составитель Л. Серова Корректор Н. Учакина Техред А. Дроздова Редактор О. Кузнецова Заказ 1990,18 Изд.504 Тираж 506 Подписное Ц 11 ИИПИ Государственного комитета Совета Мшгистров СССР по делам изобретений и открытий Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5Типография, пр. Сапунова, 2 виде смешанного полимеризата из акриламида, М,1 ч-метиленбисакриламида и ангидрида малеиновой кислоты, затем смесь нейтрализуют органическими аминами и выделяют 6-аминопенициллановую кислоту известными способами. 2. Способ по п. 1, отл ич а ющийся тем,что в качестве пенициллина применяют бензилпенициллин.3. Способ по п. 1, отл и ча ю щи йс я тем, 5 что в качестве органического амина используют триэтиламин.