Способ получения левулозы из крахмала

тент 1( технииесная-. О П И С ФГЙ-Е Союз СоветскикСоциалистическихРеспублик ИЗОБРЕТЕН ИЯ К ПАЗЕНСУ..065.79 (088,8) Опубликовано 9.79. Бюллете исания 28097 ова ата оп 7 Авторы ИностранцыИэобрЕтЕНИя Рональд Эмил Хебеда, Гарри Вудс Лич (СШАи Руаль Гийом филип (Бельгия)(71) Заявитель Иностранна СПС Интернэшнрма нкф 4) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛЕВУЛОЗЫ ИЗ КРА иниц .акти ала и, изо ив ностина ь о рахмала в водной быть от 10 до 70 зовать бактериаль тве 1,0-25 единиц сухого ферм.нта,ве Следует исполамилазу в количе ктивности на 1 30 Изобретение относится к крахмало паточной промышленности, а именно к производству левулоэы иэ крахмала.Ближайшим по техническому решению к предложенному является способ полу- б чения левулоэы из крахмала, предусматривающий приготовление воднойсуспензии крахмала, желатиннзацию суспензия, введение комплекса ферментов, состоящего из с( -амилазы, и глю коамилазы и изомеразы глюкозы и гьщролиз при рН 5-7 и 40-70 С до образованию растворимого гидролизата, со-;держащего левулозу (11.Цель изобретения - повышения эффек тивности процесса и выхода целевого продукта.Для этого в предложенном способе комплекс ферментов вводят непосредственно в водную суспензию нежелати- ф низированного крахмала и температуру реакции поддерживают в процессе гидр - лиза ниже температуры желатиниэации исходного крахмала.Концентрация к 25 суспензйи должна,глюкоамилазу - 0,1-5,0 едности на 1 г сухого крахм мразу - 0,1-20 единиц акт1 г сухого крахмала.Предложенный способ заключаетсяв следующем,В качестве исходного сырья исполэуют любой крахмал включая кукурузный крахмал иэ восковидного маиса,тапиоки, картофеля, пшеницы, соргои т.ц. Пригодны восковидные и невосковидные крахмалы, Можно использовать также кукурузные початки ицругое сырье с большим содержаниемкрахмала.Готовят водную суспенэию крахмала с содержанием последнего 1070 вес.Ъ. Исходный крахмал долженбыть в гранулированном виде, т.енежелатинизированным.Суспензия для гидролиэа должнасодержать ионы магния и кобальта.Их можно вводить в виде гексагидрата сульфата магния (М 60 6 Н О)и гептагидрата хлористого кобальта(СоСВ 7 Н О). Количество этих солейили других водорастворимых магниевых или кобальтовых солей должносоставлять от 0,005 до 0,10 молейагния на 1 л и от 0,0001 до около(сухое вещество) К другим пригодным Ы -амилаэам 30 относятся Термамил 60 (жидкость) и Термамил 120 (твердое вещество) . Ниже приведен их анализ,вещество) 1156 2105 26,5 21,2 91,2 60,1 0,04 0,72 12,2 12,3 Количество используемой бактериальной сс-амилазы составляет от около 55 1,0 до около 25 единиц на 1 г крахмала (на сухое вещество). Применениебольших количеств не дает практической выгоды; увеличенная солюбилизация крахмала.при использовании более25 единиц на 1 г не,оправдывает до полнительной стоимости энзима.с/-Амилазную активность энзимаопределяют следующим образом. Энзимудают реагировать со стандартным раствором крахмала при регулируемых ус 65 ловиях . Активность энзима определяют 0,005 молей кобальта на 1 л,в виде ионов, Эти ионы в такихконцентрациях обеспечивают активность иэомеразы и не оказывают отрицательного действия на активностьдругих энзимов,Хотя известно, что ионы кальцияоблегчают действие сС-амилаэы, нетнеобходимости добавлять их в конверсионную смесь, а в некоторых случаяхлучше их вообще не добавлять, таккак, возможно, они оказывают отрицательное действие на активность изомеразы, и соответственно на конечныйвыход левулозы.Устанавливают рН исходной суспензии равным от 5,0 до 7,0. 15Выбор рН зависит от типа применяемого в способе энзима. Идеальноразжижающие, осахаривающие и изомеризующие знзимы должны показыватьсвою оптимальную активность при одном и том же рН, но практически этогоне происходит, Глюкоамилаза является осахаривающим энзимам и его оптимальная активность достигаетсяпри рН в диапазоне 3,5-5,0. Оптимальная активность для сс -амилазы находится при рН в диапазоне 5,57,0 и она недостаточна для облегчения нужной солюбилизации крахмалапри рН ниже 5,0. Изомеразы обычнонаиболее активны при ее больших рН,например порядка 7,0-9,0. Поэтомуявилось неожиданным, что все триэнзима действуют совместно при одноми том же рН, как это происходитна самом деле. Соответствующим рНпо изобретению является диапазон рНот 5,0 до 7,0,Температура реакционной смесидолжна составлять 40-70 СОбычнотемпературу держат на верхнем пределе указанного интервала, потомучо она должна быть ниже температуры желатинизации крахмала, Этот способ дает возможнть избежать высокойтемпературы, что позволяет экономитьна подаче тепла и сводить к минимумуобразование окрашенных веществ и,следовательно, экономить на последующей очистке,В водную суспенэию крахмала непосредственно вводят комплекс. ферментов,состоящий из с-амилазы, глюкоамилазы и изомераэы монозы.Предпочтительно использовать бактериальную сБ -амилазу,которая сохраняет активность при сравнительнонизком значении рН, т.е. в диапазоне 5,0-7,0, а также при сравнительнонизкой температуре, т,е, ниже температуры желатинизации крахмала, Клучшим источникам такой сс,-амилазыотносятся некоторые виды микроорга,низма:, Вас 1 Ииэ, . например Вас 1 Иоэ зоЬБГлэ, В. ИсйещХогт 1 Б, В.соарцбапк и В аачВоЙдцКас 1 епэ.Особенно хорошими являютсясс -амилазы, полученные из В ИспеюХогт 1 з штамм Р С 1 В 8061. К другим специфичным микроорганизмам относятся В.81 спеп 1- 1 ов 1 штаммы. ИС 1 В 8059, АТСС 6598, АТСС 6634, АТСС 8480, АТСС 9945 А и АТСС 11945, Один такойо -амилазный препарат имеет торговое наименование Термамил, фирмы Ново Терапевтик Лабореториум, Копенга ген, Дания. Термамил термически стоек, имеет широкий диапазон действия при разных рН, а) его активность и термостойкость не зависят от наличия ионов кальция. Ниже приведен анализ этого препарата,Сухое вещество,Ъ 94,6Активность сс-амилазы, ед/г Термамил 60 Термамил 1205 10 15 20 8 - В 2 хЕ 25 30 35 40 45 по степени гидролиза крахмала, определяемой по уменьшению окрашиванияиодом и измеряемой спектрофотомет, рически. Единицей активности бактериальной сс-амилаэы является количестно энзима, требующееся для гидролиза 10 мг крахмала в 1 мин приусловиях опыта. Этот метод применимк бактериальной . -амилазе, включаяпромышленные препараты, кроме веществ, обладающих значительной оса"харивающей способностью,0,3-0,5 г твердого образца или,2,0-1,0 мл жидкого образца растворяют в до:таточном количестве0,0025 М водного раствора хлористого кальция и получа " энэимныйраствор, содержащий голо 0,25 единиц активности на 1 мл,Смесь 10 мл 1-ного раствора крахмала Линтнера, уравновешенная доо60 С, и 1 мл образца знзима, подлежащего испытанию, смешивают и держат при постоянной температуре 60 Св ванне в течение 10 мин, Отбираютпробу в 1 мл и добавляют к смеси 1 мл1 М водного раствора соляной кислотыи около 50 мл дистиллированной воды.Способность к окрашиванию иодомтакого подкисленного образца определяют затем добавлением 3,0 мл0,05 -ного водного раствора иода,разбавлением до 100 мл дистиллированной водой. Смесь хорошо перемешивают,Спектр поглощения раствора, по сравнению с дистиллированной водой, измеряется при 620 нм в кювете на 2 см,Такое же измерение ведут для стандартного крахмального раствора (к которому добавлена вода вместо энэимногораствора) для создания холостого поглощения,Активность энзима в ед/г илнед/мл равна; (холостое поглощение -поглощение пробы) - к коэффициенту .1 раэбавления х 50/холостое поглощениедх 10 х 10,В качестве глюкоамилазы можно применять известные препараты амилаэы, особенно полученныеиз членов рода АзрегрИцэ, родаЕпдотэсеэ и рода КИ 1 ьорцз. Особеннохорошей глюкоамилазой является глюкоамилаза, получаемая по способу,по которому грибковый амилазный препарат.очищают от нежелательной трансглюкозидазной активности путем обработки в,водной среде глиной. Количество применяемой глюкоамилазы колеблется от 0,1единицы до 5,0 на 1 г крахмала (сухоевещество) .Лучше, исходя из стоимостиэнзима и работы, применять 0,25 единицы глюкоамилазы на 1 г крахмала (сухое вещество).Единицы активности глюкоамилазыопределяют следующим образом.Субстратом является- кислый гидролизат 15-18 ДЕ кукурузного крахмала в воде разбавленный до 4,0 г .сухого вещества на 1000 мл раствора. Пипеткой отбирают точно 50 мл раствора в объемную колбу на 100 мл, В колбу добавляют 5,0 мл 1 М кислого буФера ацетат натрий - уксусная кислота (рН 4,3), Колбу помещают воводяную ванну при 60 С и через 10 мин добавляют нужное количество энзнмного препарата, Точно через 120 мин после добавления энзимного препарата раствор доводят по ФенолФталеину 1 И раствором едкого натрия, Затем раствор охлаждают до комнатной температуры и разбавляют до полного объема,На разбавленном образце определяют величину редуцирующего сахара в пересчете на декстроэу и на контрольном образце беэ добавления энзимного препарата. Глюкоамилазную активность рассчитывают следующим образом: где А - глюкоамилазная активность в единицах на мл (или на грамм) энзимного препарата; В - рЕдуцирующие сахара в пробе конвертированного энзима в граммах на 100 мл; В - редуцирующие сахара в контрольном образце, граммына 100 мл;Е - количество использованногоэнэимного препарата, мл(или грамм)Я не должно превышать 1,0 г на 100 мл.Изомераза может быть любой, например энэим, способный конвертировать декстрозу в левулозу. Известно много иэомераз, включая, в основном, те, которые получены с помощью микроорганизмов вида Я 1 гер 1 отчсеэ. Предпочтительным видом является ЯаВЬцз ЭТ-ФБ (АТСС 9 21132) .К другим относятся 3 ооЬ 1 Иае 5 гаЙае, Б.чюасепз, Б.чгрп(ае,5.ок 1 чосьготоепеэ и Ь.рйаеосЭговодепеэ 50 Изомеразы, полученные с помощью микроорганизмов вида Аг 1 ЪгоЬас 1 ег также можно применять, например,А.поч.бР и 1 ЩЬ В 3724; А поч.еР тЦ. В; А.почврбйяЬ В;А.поч.ар.йййЬ В 3727 и А.поч.эр иййьВ.А также изомеразы, полученные с помощью микроорганизмов вида) ас 1 обас 1 Ицз, нацримеР (Вгеч 1, Ь.ьапЪЙореп и Ь.Ъцс 1 пег(, а также АегоЬасЯег сЬЕоасае и А.аегодепез 60 Количество применяемой иэомеразыколеблется от 0,1 единицы до около20 единиц на 1 г крахмала (сухоевещество)Обычно в предпочтительныхслучаях это количество составляет 65 0,2-2,0,688138 омпонен иль тра 7 Н О М М 529,3 365 3 62 57,4 Д.Е. фильтраДекстрозыв фильтрате,Фатный буф ная Д-глюк 1 М рН 0,5 м Безв а о общег бъема 7 6 т 0,22 91,вуло 51,0 строэа О Зола ( сульфат с 1.е. ) 5 Кра я проба отрицательна Единицы изомераэной активности определяются следующим образом.Ведут спектрофотометрическое опре.деление кетонов,образующихся иэ раствора глюкозы при стандартных условияхПодлежащий анализу энзимный препарат ,сначала разбавляют до содержания 1-6 единиц иэомеразы в 1 мл, Затем готовят раствор:К т Количество 01 М СоСВ 6 Н О 1 Дистиллированная вод Энзимную изомериэацию ведут добавлением 1 мл энэимного препаратак 3 мл раствора. Затем ведут инкубаОцию его в течение 30 мин при 60 С.В конце инкубационного периода отбирают пробу 1 мл и быстро прекращают реакцию. добавлением 9 мл 0,5надхлорной кислоты, Затем эту пробуразбавляют до объема 250 мл. Длясравнения в качестве контрольногоопыта эту процедуру повторяют,новместо 1 мл энэимного препаратав виде раствора берут 1 мл водыв начале инкубационного периода.Затем кетозу определяют методомцистеин серная кислота.,Для этого анализа изамеразнуюединицу определяют как количествоэнзимной активности, требующеесядля получения 1 микромоля левулоэыв 1 мин при описанных условиях иэомеризации,В процессе гидолиэа крахмалатемпературу реакции подцерживают ни"же температуры желатинизации исходного крахмала для того, чтобы сохранить крахмал в.гранулированном, не"желатиниэированном состоянии в течение всегОпроцесса, что приводит кувеличению выхода целевого продукта.Непрореагировавший крахмал удаляютиэ гидролиза путем Фильтрации ивозвращают его в процессе.П ри м е р 1. К 32,7 (18,4Боме) водной суспензии гранулированного кукурузного крахмала добавляют0,01 моля ионов магния (в виде гексагидрата сульфата магния) и 0,001 моляионов кобальта (в виде гептагидратахлористого кобальта), рН доводят до5,7, Для поддержания рН на этом уров"не при необходимости добавляют 1 Нводный раствор карбоната натрия, Температуру держат при 60 С и добавляют0,07 5 (6,8 единиц активности на 1 г крахмала) с 6-амилазы, 0,1 (02 единиц активности на 1 г крахмала) глюкоамилаэы и 0,8 (0,33 единиц активности на 1 г крахмала) изомераэы (61 гер 1 опч - сез аВЬоз УТ) . Результаты приведены в таблице.24 26,4 29,8. В пересчете на твердое вещество.Растворимая фракция находитсяв фильтрате, полученном после Фильтрования конверсионной смеси, филь 20 трация идет легко, так как в конверсионной смеси нет желатинизированного крахмала. Количество гранулированного крахмала, полученного послеокончания реакции, составило 425 от всего количества,7 3 крахмала солюбилизируются за18 ч с выходом 29,3 (из .расчетана солюбилизированный крахмал)левулеэы, По прошествии 42 ч соответ 30 ствующие цифры составляют 81 солюбилизированного крахмала и 36,3левулозы, По прошествии 7 ч соответствующие цифры составляю 91 и38,9,З 5 П ример 2. К 40 9 (23 Боме)вс .,ой суспензии гранулированногокукурузного крахмала добавляют ионыкобальта и ионы магния, как в примере 1. рН доводят до 5,7 и держат на4 О этом уровне во время конверсии добавлением 1 И водного раствора карбоната натрия по необходимости, Температуру поддерживают 60 С и добавляют0,15 (13,7 единиц активности на 1 гкрахмала) с -амилазы Термамил, 0,1(0,2 единиц активности на 1 г крахмала) глюкоамилазы и 0,8 (0,33 единицактивности на 1 г крахмала) изомераэы ( Ы ср 1 огпъсез а С Ь оз УТ)Суспенэию держат при 60 С в течение48 ч, затем фильтруют. Ниже приведенанализ фильтрата,ДЯ 4 ересчете на твердое вещество.10 688138 Составитель Г,ЛошкареваРедактор Т.Иванова Техред Л,Алферова Корректор Е.ЛУкач Заказ 5561/56 Тираж 408 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб.,д.4/5,филиал ППП фПатент, г.ужгород, ул.Проектная,4 Свыше 98 крахмала солюбилизируютсяв течение 48 ч и 40,7 этого солюбилизированного крахмала превращаетсяв левулозу,П р и м е р 3. Готовят 25 вес.водную суспензию гранулированногокукурузного крахмала, которая содержит следующие ингредиенты: 125 г кукурузного крахмала; 250 мл 1,0 Иводного фосфатно-калиевого буфера,рН 7,5, 5 мп 1,0 И раствора гекса,гидрата сульфата магния, 5 мл 0,1 Нраствора гептагидрата хлорида кобальта и достаточное количество водногохлорида кальция;о-амилазу (Во: Р 0 оз МсЬещЮогМэ ),5 единиц активность. на 1 г крахмала(сухое вещество), глккоамилаэы 1 единица активности на 1 г крахмала(сухое вещество); изомеразу (Ыгер 1 овчсез обчосЬготодепеа) 10 единиц активности на 1 г крахмала в пересчетена сухое вещество,Эту водную суспенэию держат при60 С в течение 24 ч рН доводят до6,0 и по необходимости поддерживают на этом уровне добавлением водного раствора едкого калия. Конверсионную смесь фильтруют, фильтратдоводят до рН 4,5 добавлением соляной кислоты, затем кипятят для де"эактивации энзимов. В твердом веществе содержится 44,9 исходного гранулированного крахмала, что означает, что 55,1 гранулированного крахмала солюбилизировалось. В солюбилиэированном крахмальном продуктесодержится 51,2 декстрозы и 20,6 левулозы в пересчете на на твердоевещество.Формула изобретения 1, Способ получения левулозы иэкрахмала, предусматривающий приготовление водной суспензии крахмала,введение комплекса ферментов, состоящего из а.-амилазы, глюкоамилазыи иэомеразы глюкозы при рН 5-7 и40-70 С и гидролиэ до образованиярастворимого гидролизата, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с цельюповышения эффективности процессаи выхода целевого продукта, комплексферментов вводят непосредственно вводную суспенэию нежелатизированного крахмала и температуру реакцииподдерживают в процессе гидролизаниже температуры желатинизации исходного крахмала,20 2, Способ по п,1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что концентрациякрахмала в суспенэии составляет от10 до 70 вес3. Способ по п1, о т л и ч а ю 25 щ и й с я тем, что используютбактериальную амилазу в количестве1,0-25 единиц активности на 1 гсухого крахмала, глюкоамилаэу в количестве 0,1-5,0 единиц активности30 на 1 г сухого крахмала и изомеразу0,1-20 единиц активности на 1 гсухого крахмала,Источники информации, принятые" во внимание при экспертизеЗ 5 . 1. Патент Франции Р 2215467,кл, С 13 К 1/06,опублик.1974,прототип.