Способ получения бяс-мочевинного аддукта антибиотика

Зависимый от патента1. К 07 с 125/00 07 а 11 Г 00 аявлено 10 Л 1,1969 ( 1303492/23-4)Приоритет Ноюитет по авлаеаобретеиий и открытийпри Совете Мииистров Д 1 Опубликовано 7 Л 11 Л 972. Бюллетень9 Дата опубликования описания 13,1 Ч.1972 СсСОЮЗНАП АТОНП 1с ц 1,.4 цсг(( Авторыизобретения Иностранцы Херман Мэссей, Артур филлипп Раун и Ричард(Соединенные Штаты Америки) Иностранная фирма Зли Лилли энд Компаниин Клаин Заявцтел ПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИС-МОЧЕВИННОГО АДДУ АНТИБИОТИКА2 Предложенный способ получения бис-моче- винного аддукта антибиотиков - макролидов, содержащих альдегидную группу, состоящий в том, что водный раствор соли антибиотика насыщают избыточным количеством мочевицы общей формулы ХН - СО - Атп, где Агп представляет собой группу - М- К, в которой Й - фенил, толил, галоидзамещенный фенпл или трифторметил-фенил, или группу К - И - К", причем К и К" могут быть либо1водородными атомами, либо С, - С 4-алкпльными, либо Сз - С 4-алкенильцыми радикаламп, и сумма углеродных атомов в К и К" не превышает 4.Указанные компоненты берутся пз расчета, по меньшей мере, 2 моль мочевпны ца 1 моль антибиотика.После подщелачцвация реакционной смеси аддукт выделяют обычными приемамц,П ример 1. Бис-мочевшшый аддукт тило- зина.100 г тилозцнового эфира винной кислоты растворяют в водном растворе мочевины (100 г мочевины и 100 мл воды). Полученную смесь выдерживают до тех пор, пока методом тоцкослойной хроматографии не определят практического окончания реакции образования продукта присоединения. При проведении анализа методом тонкослойной хроматографии на сплпкагеле используют систему растворителей диэтиламин - этиловый эфир уксусной кислоты в соотношении 1:9. Прц применении этой системы аддукт тцлозина и бис мочевины остается неподвижным, в то времякак тилозин увлекается растворителем.Из реакционной смеси аддукт тцлозпца ибис-мочевины выделяют при добавлении к ней 2 объемов воды с последующим доведе цпем рН раствора до значения, равного примерно 9, с помощью 10% -ного водного раствора гидроокпси натрия. Затем в смесь добавляют твердый хлорцстый натрий до тех пор, пока не выпадает,в осадок неочищенный 15 аддукт тилозцна и бис-мочевппы в виде желтого клейкого твердого вещества, которое отделяют фильтрованием. Осадок па фильтре растворяется в хлороформе. хлороформ промывают водой, сушат и отгоняют пз раствора 20 в вакууме. В результате получается аддут тплозпца и бис-мочевцны в виде бледно-желтого аморфного твердого вещества, Это вещество тщательно сушат прц пониженном давлении, чтобы по возможности наиболее полно 25 удалить хлороформ, Затем сухой твердыйпродукт растворяют в безводном ацетоне, взятом из расчета 5 мл на 1 г продукта, и полученный раствор охлаждают. Выпадают белые игольчатые кристаллы аддукта тилозина с 30 двумя молекулами мочевины, которые отделяют при фильтровании. Т. пл. полученного продукта 220 - 222 С.Вычислено, %: С 56,22; Н 8,39; Ь 1 6,96С 47 Н 8 з 115 О8.Найдено, %; С 56 05; Н 832; г 1 672.В ЯМР.спектре аддукта, характерного для альдегидной группы протона не обнаружено, Аддукт биологически неактнвен против микроорганизмов, на которых обычно ставится проба тилозина,При растворении данного аддукта в водном растворе кислой реакции, рН которого поддерживается в диапазоне от 4 до 7 общепринятыми способами для буферов, выделяется тилозин и некоторое количество дисмикозина - продукта кислотного гидролиза тило- зина,Аддукт тилозина и бис-(3-метилмочевины) получают, заменяя в вышеописанной методике мочевину на Х-метилмочевину, Вместо моче- вины или М-метилмочевины для получения аддуктов бис-мочевины и антибиотиков с макроциклическим лактонным кольцом могут быть использованы иные мочевины, которым отвечает приведенная выше структурная формула. Ы числе таких мочевин, которые могут ооразовать аддукт бис-мочевины, следует указать аллилмочевину, Г 1,Х-диэтилмочевину, этил мочевину и Х -метил-Х -н-пропил мочевину. Указанные соединения растворимы в воде и возможно получение из них аддуктов с двумя молекулами мочевины по вышеописанной методике без каких-либо ее изменений. В случае таких соединений, как М-(м-толил)-моче- вина, Х-фенилмочевина, 3- (тетра-бутил) -мочевина и Х- (и-трифторметилфенил) -мочевина, вместо водных растворов используются спиртовые растворы как мочевины, так и соли тилозина.П р им е р 2. Бис-мочевинный аддукт магнамицина в 5 мл насыщенного водного раствора мочевины растворяют в 2 г магнамицина, причем рН раствора поддерживают в диапазоне от 5,0 до 5,5, добавляя при необходимости 10%-ную водную соляную кислоту. Выдержав смесь при комнатной температуре 12 дней, раствор разбавляют 4 объемами воды. Водный раствор экстрагируют 40 мл хлороформа при следующих рН: 5,0; 5,5; 6,0; 6,5 и 7,0. Перед каждой экстракцией необходимое значение рН раствора устанавливают добавлением 10% -ной водной гидроокиси натрия. В каждом из этих экстрактов присутствует аддукт мочевины, но лишь экстракты растворов с рН 6,5 и 7,0 практически свободны от магнамицина. Экстракты при указанных высоких рН сливают, выделяют аддукт магнамицина с двумя молекулами мочевины и очищают способом, применяемым в примере 1 прн получении аддукта тнлозина с двумя молекулами мочевины. Получено 0,5 г белого твердого вещества, спектр которого в ультрафиолетовой области типичен для магнамицина Лш.240 ммк в 13000). В ЯМР-спектре аддукта отсутствует сигнал протона альдегидной группы,5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 Биологическими исследованиями аддукта с двумя молекулами мочевины была установлена его неактивность против микроорганизмов, используемых в качестве общепринятых тестов дчя магнамицина.Магнамицин выделяют из продукта присоединения двух молекул мочевины к магнамицину, выдерживая аддукт в автоклаве при 120 С в течение 20 мин при рН=5.11 р и мер 3, Продукт присоединения к спирамицину двух молекул мочевины,В 50 мл насыщенного водного раствора мочевины растворяют 2 г спирамицина А, причем рН раствора поддерживают в диапазоне от 4,о до 5,0, добавляя при необходимости 10%-ную водную соляную кислоту, Выдержав раствор при комнатной температуре в течение 1 дней, смесь разбавляют четырьмя объемами воды и подвергают последовательной экстракции аналогично примеру 2; рН составляет 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0; 8,5; и 9,0. При каждой эксгракции применяют 40 мл хлороформа. Экстракты при рН=8,0; 8,5 и 9,0 объединяют и добавляют 1 г аддукта спирамицина и бис-мочевины в виде белого твердого вещества. Спектр аддукта в ультрафиолетовой области практически совпадает со спектром самого спирамицина А. ЛП,230 ммк в 23000). ЯМР-спектр аддукта сопоставляют со спектром спирамицина А, за исключением того, что отсутствует сигнал протона альдегидной группы,Аддукт спирамицина и бис-мочевины можно перевести снова в спирамицин, растворяя 20 мг аддукта в 1 мл этанола, затем добавляя 4 мл буферного раствора при рН=5,5 и выдерживая смесь в автоклаве при 120 С в течение 20 мин,Аналогичным способом можно получать продукт присоединения двух молекул мочевины к другим антибиотикам с макроциклическим лактонным кольцом, содержащим альдегпдную группу, включая такие антибиотики, как макроцин, десмикозин, лактеноцин, карбомицин, карбомицин В, ниддамицин, другие члены серии спирамицинов и члены ряда лейкомицинов.Соединения настоящего изобретения используются в качестве промежуточных продуктов при получении производных от различных антибиотиков с макроциклическим лактонным кольцом, перечисленных выше,Например, при взаимодействии мочевины и альдегидной группы тилозина, приводящем к образованию стабильного в щелочной среде бис-мочевинного аддукта, возможно восстановление кето-группы тилозина борогидридом натрия. При этом после гидролиза кислотой двух молекул мочевины образуется новое соединение - либо дигидродесмикозин, либо дигидротилозин, что определяется рН и продолжительностью стадии гидролиза. Вполне очевидно, что подобное восстановление невозможно у тилозина или десмикозина, так как в присутствии альдегидной группы ппи45 50 55 60 соединение борогидрида натрия идет преимущественно по месту этой группы, а не кето -группы.Полученным таким образом дигидро-(кетонвосстановлен) -тилозину и дигидро-(кетон восстановлен) -десмикозину отвечают такие характеристики антибиотиков, которые сравнимы с харак 1 ерпстиками исходных тилозина идесмгп ознна. Применение этих новых антибиотиков аналогично тилозину и десмикозину.Они являются средством для уничтожения таких микроорганизмов, как Ь. ацгець, Я. агс 1 па1 ц 1 са, В, зцИ 11 з, Так, например, растворы дигидро-(кетон восстановлен) -тилозина и дигидро-(кетон восстановлен) десмикозина могут применяться для дезинфекции госпитальных помещений, лабораторной стеклянной посуды и т. д.П р и м е р 4. Бис-мочевинный аддукт дигидро- (кетон восстановлен) -тилозин.В 450 мл 95/,-ного этанола растворяют17 г бис-мочевинного аддукта тилозина и650 мг борогидрида натрия. Реагирующуюсмесь выдерживают в течение ночи, а затемразбавляют 400 мл воды. Этанол выпариваютв вакууме. Полученный водный раствор экстрагируют 100 мл хлороформа. Слой хлороформа отделяют и сушат, а затем из экстракта в вакууме отгоняют хлороформ. Остатокимеет вид аморфного белого твердого вещества. На тонкослойной хроматограмме этомупродукту отвечает единственное пятно. Приперекристаллизации белого твердого веществав ацетоне выделяется кристаллический бисмочевинный аддукт дигидро-(кетон восстановлен)-тилозина,П р и и е р 5. Дигидро-(кетон восстановлен)десмикозин.В 300 мл воды растворяют 9,1 г двухмочевинного аддукта дигидро-(кетон восстановлен)-тилозина, 10% -ной водной соляной кислотой рН раствора доводят до значения, примерно, равного 2,8,Гидролизуемую смесь выдерживают в течение 4 дней при комнатной температуре, Водную реагирующую смесь экстрагируют хлористым метиленом при следующих значенияхрН: 6,0; 6,5; 7,0; 8,0 и 9,0, которые устанавливают перед каждой экстракцией добавлением10 О/о-ной водной гидроокиси натрия, Экстракты растворов со значением рН 7,0 и 8,0 объединяют. Они дают единственное пятно на тонкослойной хроматограмме. При выпариваниииз этого суммарного экстракта выделяют 5,2 гдигидро-(кетон восстановлен) -десмикозина ввиде аморфного белого твердого остатка. Прирастворении этого продукта в минимальномколичестве горячего хлороформа с последующим медленным охлаждением раствора получают 2,2 г кристаллического дигидро-(кетонвосстановлен) -десмикозина, распадающегосяв диапазоне от 70 до 80 С. 5 10 15 20 25 30 35 40 6Найдено, %: С 60,05; Н 8,62; Х 1,84Сз 8 НыХО 14Вычислено, %: С 59,76; Н 8,48; Х 1,86.Дигидро- (кетон восстановлен) -десмикозин также можно получить при гидролизе бис-мочевинного аддукта дигидро- (кетон восстановлен)-тилозина при 100 С, рН 3,6 в течение 1,5 час. Экстракцией гндролизуемой смеси хлористым метиленом можно непосредственно выделить необходимое соединение.Дигидро-(кетон восстановлен)-десмикозин может подавлять, размножение 5. ацгецэ . агс 1 па 1 ц 1 еа В. зцЬШ 1 з, если концентрация его в бактериальной среде 10 мкг/мм.П р и м е р 6, Дигидро- (кетон восстановлен)- тплозин.Растворяют 10 г бис-мочевинного аддукта дигидро-(кетон восстановлен)-тилозина в минимальном количестве нагретого этанола, и полученный раствор разбавляют 450 мл буфферного раствора солей лимонной и фосфорной кислот. Лимонной кислотой рН раствора доводят до 5,0 и выдерживают раствор примерно при 90 С в течение 30 мин. Реакционную смесь при рН 5,0 - 5,5 (при необходимости рН регулируют разбавленной гидроокисью натрия) экстрагируют хлористым метиленом. В результате выделяют 5,7 г дигидро- (кетон восстановлен)-тилозина в виде белого аморфного вещества. На тонкослойной хроматограмме ему соответствует одно пятно, которое перемещается с иной скоростью, чем тилозин в аналогичной системе, Дигидро- (кетон восстановлен) -тилозин подавляет развитие 5, ацгецз, 5. аге 1 па 1 ц 1 еа, В. зцЬШ 1 з если его концентрация в бактериальной среде 10 мкг/мм.Таким образом вполне очевидно, что можно получить и другие соединения с кетонной карбонильгруппой, тилозина, если альдегидная группа блокирована мочевиной, и что подобные изменения возможны и в отношении других антибиотиков с макроциклическим лактонным кольцом. Предмет изобретенияСпособ получения бис-мочевпнного аддукта антибиотика, отличающийся тем, что макролидный антибиотик, содержащий альдегидную группу, смешивают с мочевпной формулы ХН - СО - Апт, где Ат представляет собой группу - ХН - К, в которой К - фенил, толил, галоидзамещенный фенил пли трифторметилфенил, или группу К - М - К", причем К и К"могут быть либо водородными атомами, либо С 1 - С 4-алкильнымп, либо С - С 4-алкенильными радикалами,и сумма углеродных атомов в К и К" не превышает 4, при молярном соотношении мочевины к антибиотику 2:1 в нейтральной или основной среде, и целевой продукт выделяют обычными приемами,