Штамм бактерий bacillus вrеvis-продуцент рестриктазы в bi

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК11 1) 1/20 1)5 С К АВТО ской рной ЗльА.Кана и Мауег 2, р.(57) Исполтика научмолекуляческой ин Изобретение от гии и может быть ис научно-исследовател лярной биологии, б инженерии,Целью изоштамма бактеэндонуклеаэуфичностью 56выходом,Поставленчто биомассу Ввеют в аэробн ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕВЕДОМСТВО СССРГОСПАТЕНТ СССР) А.ИЕ ИЗО КОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ(71) Институт биологической и медицинхимии АМН СССР и Институт молекулябиологии им. В,А.Энгельгардта(56) 1. Кгоцег М., НоЬоп) 63 спиое НН. Й 0 се 1 с Асоз: йезеагс), 1984, ч,3127 - 3141,2. Авторское свидетельство СССРМ 1170777, кл. С 12 й 9/14, 1983. М БАКТЕРИЙ Васоз Ьгдуз НТ РЕСТРИКТАЗЫ ВьчВ ьзование: биотехнология и пракно-исследовательской работы в рной биологии, биохимии генетиженерии. Сущность изобретения: осится к биотехнолопольэовано в практике ьской работы в молекуохимии, генетическОй ретения является получение рий, продуцирующих новую рестрикции ВьчВ 1 со специ Т/СКА/6)ССЗ с высоким ная задача достигается тем, . Ьгечз ВКМ Ввыращицх условиях в питательной продуцент В. Ьгечз ВКМ Ввыращивают в аэробных условиях в питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли до поздней логарифмической фазы роста, целевой продукт выделяют из полученной биомассы известными методами, Биомасса В. Ьгеч 1 з ВКМ Всодержит новую сайт-специфическую эндонуклеазу ВьчВ 1, узнающую и расщепляющую последовательность ДНК 56 С(Т/С)(А/6)ССЗв количествах, достаточных для получения рестриктаэы в препаративных масштабах, содержание рестриктазы ВьчВ 1 в биомассе 7000-10000 ед на 1 г сырого веса. Для изошизомера ВьчВ 1, рестрик тазы НдС 1, вцходочищенного фермента не указан. Выход очищенного препарата рестриктазы ВьчВ составляет 1200 - 1500 ед, на 1 г сырой биомассы. Эндонуклеаза рестрикции ВьчВ не содержит примесей фосфатаэ, неспецифических эндонуклеаэ и зкзонуклеаз,среде, содержащей источники углерода, затем и минеральные соли до поздней логарифмической фазы роста, целевой продукт выделяют иэ полученной биомассы известными методами,Эндонуклеаза рестрикции ВьчВ 1, изошиэомер НЦ 1 С 1, узнает и гидролизует участок нуклеотидной последовательности ДНК 566(Т/С)(А/6)ССЗ. Рестриктаза расщепляет ДНК фага Я по 25 участкам, ДНК аденовируса Ас 2 по 57, ДНК обезьяннего вируса Р/40 по 1, ДНК фага ОХ 174 по 3 и плазмиду рВР 322 по 9.1 го(ЛС 3; и ТДММД-г)3)гЭДУ 3(Е ГЛ 33;)г)гзо)(ИЛ(1П р и П О М О Ши р д 3 Г) д О г) Та 3 гг) г Г; г,л И ., г г1Г Р Е С С-М СТО П а ГЕ " и О Г) р:И;стриктдз в тОлуольнь;х зкс) )(3 гдх,з к,ется;МИКОООГ)Га 33 гЛЗ(ЛОЕ) С ПОСЛЕ г)(ГГ 3 ЦИГЛ З 3 Г;.К ГРОфоОЕЗОМ П)С)г)(г 3(-О( Р,-3333)ч(1 нг 1)," ; ,;г)31 З 5 ) 1 3 Г%Нд)Л(г ИЗ гБССОО К)гой 3(.- г 3 р 1,(тг.:3 г(ОО(3)ОЛО плоски( ООбе 3. " ., .33- КЗЛ, ГЗО(3 Э 3)3 г 333, г)(5(П) 3 у; г г г 1, г;г) г,г;Г;,3313 3)Д)Л 3 Оа 3 иКуЛЬГ)г)Г(Ь 33(3"33333333 г " " гг ,гЬД С 3(О 3)Е 3333 г)3 И аГЛОЕ РОгТг " г г3.)ый, м( лг 33(, 6 ес 331,3)е ,ог 33 л 13 лг(В "1)3 ЕТГ)и С МЯСОПЕПТО 333 Ь 3: 3 ага о;.3;,Е)3 КЗЛг)бле;т 333 цие, г 3 адкие коло 33(3;," л"(ТОН(3 О 3 б)гГЛ 3 )г 3 Е 33 гГг 3 г 3 о3,1 , г,3.О 3 Л Е Р Н ОП О М В Г 3Г 3И З О " Г -, ;Отное.ие 3 к 3 спрол.)э,".,Ти)3 иэа 33 ИЛ УГП/),)г",)33 а г.г 33,):,;" 3 СЛота . Гаэ + 3) 3 Л;31,Индол и сероводрд;: О 3)з г,ъ 3(033 Т 3)МДЛЬ 33 ЫО УС(С) .л:,(3,:)3 ,;:Х 3)ДНЕ).33 л 3 К(13 ГУОЫ,Куль;ура В. Ьг)чг) ВКгЛ В9 хо,)(;)3 сРЭСТЕт ВУСПОВИЛХ )ЭРДЦ 313 33,3; Г (, 3-, Гг,г)3,ОНО )ОТТИНГ3, сг)ле)3(а 3 е 3 ) "г 1 Г(33(Г)Э 3,без Гл)окозь), на (,раде с 3)д)гллиэз)ок 3 пК)Л И Срвдц .В. П)3 Л ВЫГ)л.; г Ч ".: ": (П,гг;1И г С на каОй,.е 3 а )аз 3 3 и.,; )Тег(Е)33" 10: 133 пгг(3 И- Г "-); "глюкозь 3 1,(; срг:313;) 3- 1,.), (;3 к. :;.,:,(г(лд:)0333 лззто 33 2,31,(3)Е3)Е 3)ТЛГцн 3 Г, ГГ:. гдобавлен)я в фе) 3 пт,.ношении 3 10 к Обьему с)Оп) И 3)ум рос га ,гпг;.17 оС33 Д(г 3 ОЕЕ ВЫСОКОЕ 33 ДКПП)3 Г",;:г Эг ; "-3СТИ 3 р)ЕСТр 3 г)3 ТдЗЬ 3 Ь), 3 3.Маг .р );О.,;С;П.дит )ри вы Оа шива нииферментере при 37" С с дэ)Лциг)й:,з сосо .)г)киД 3(ом мясо"пеп Годном агдг 3 е и) )Л,.-г)(3НОВЫМ (Л а С)3 О М 33 Л.В ) 3 3 Л О ф3 г) И 3 3 3 р г) ) Гг Н 3 3 О Мг)иде в ампулах,Выделение рестриктазы ВьВ и рояодлт фрдкционированием в двухфазной сисге(ие 3 оп и этил ен гл и кол ь/декст ран и)г)3 кубационндя смесь для определениядктигп(ости рестриктдзы Б 3 гВ, объемом 40 -50;:3 Г 3, г)г 1 е 3):.:,л 0,01 М трис-НО, рн 7,5,. ", Г.; 3 П)г;:,:.)Г 3(3 ГЕГЗЬНО аДаПтИРУЮт В ТЕЧЕ,г. п п) 37"С в условиях аэрации наС"; " ,Н Зг" Э) г Ь 33 О) С)г),г)Е, СОДЕРжаЩЕй Вл; Г",.3)(1 пи) 13 кип 3,к 3 л 33,0 г; МЭО 7,0 г; доЧг.))пят дпл посева в ферментер гото ПГЗО 31 Т 3 г)3)Ог)ану(О КуЛЬтуру Нал .:, ,.;),г) з расчета 1;10, и размногЛГ 3; ГП 33,Ю;Чл Ь,Г)Ы ПРОВОДт ПОСЛЕ1832129 лозой Р 11 "МВасгпап", Англия) и гепаринсефарозой С-бВ ("РЬаггпаса", Швеция).Получают 15000 ед. активности фермента в 5 мл буфера с 50 глицерином, Выходочищенного препарата рестриктазы ВьчВ 5составляет 1500 ед. на 1 г сырого веса биомассы, Активность фермента не снижаетсяпри хранении при -20 С в течение б - 8 мес,Препарат рестриктазы ВьВ не содеркит примесей фосфатаз, экзонуклеаз и неспецифических эндонуклеаз и пригоден дляцелей молекулярного клонирования и структурных исследований ДН К.П р и м е р 2. Культивирование штаммаВ, Ьгечв ВКМ В-б 79 проводят аналогично 15описанному в поимере 1, за исклкчениемтого, что в качестве питательной среды используют среду, содержащую в 1 л: 250 млосновного перевара Хоттингера; 5 г МаС; 1г К 2 НР 04; до 1 л Н 20, 20Выход биомассы 4-5 г/л культуральнойжидкости,Содержание эндонуклеазы рестрикциив биомассе 7000-8500 ед/г сырого веса,После проведения очистки фермента, 25как описано выше, выход рестриктазы Вь Всоставляет 1200 ед, активности/г сырого веса биомассы,Таким образом, цо предлагаемому способу получают новую зндонуклеазу рестрикции ВьуВ.Биомасса штамма В. Ьгейз ВКМ Всодержит новую сайт-специфическую зндонуклеазу ВьчВ, узнающую и расщепляющую нуклеотидную последовательность 5 Бб(Т/А)(А/6)ССЗ в количествах, достаточных для получения фермента в препаративных масштабах содержание рестриктазы В 1 В в биомассс 7000-10000 ед/г сырого веса. Выход очищенной рестриктазы Н 9 С, изошизомера Вь В, авторами не указан 11.Для оестриктазы ВьВ выход очищенного фермента составляет 1200-1500 ед, на 1 г микробной массы,Эндонуклеаза рестрикции ВьВ не содержит примесей фосфатаз и неспецифических нуклеаз,-( 3 ый фермен ь;о,е 1 быть использо" ван в биотехнолопгческих и генно-инженерных исследованиях,Формула изобретения Штамм бактерий Васцв Ьгейз ВКМ Вб 79 - продуцент рестриктазы ВьВ,Составитель А. ТочилкинТехред М.Моргентал Корректор Л, Филь Редактор Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул,Гагарина, 101 Заказ 2604 Тираж ПодписноеВНИИГИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5