Штамм метилотрофных дрожжей hansenula роlyмоrрна-продуцент алкогольоксидазы на среде с глюкозой

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 5 С 12 й 9/04, 1/1 ОПИС ВТОРСКОМУ СВИД ЬС тута оиохииныеминская,ие Инст АН Укр Г.П.Кш ревская ьство С /04, 198 р. Генет ика, 1986, т,4 ЫХ ДРОЖРОДУЦЕНТ ЕДЕ С ГЛЮ(54) ШТАММ МЕТИЛЖЕЙ Напзепц)а роуеАЛКОГОЛЬОКСИДАЗКОЗОЙ ТРОФН рйа - П НА СР ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОВЕДОМСТВО СССР.Изобретение относится к биотехнологии, а именно к микробиологической промышленности, и касается штамма-продуцента алкогольоксидазы с конститутивным синтезом этого фермента;Цель изобретения - получение штамма, обеспечивающего синтез алкогольоксидазы в средах. содержащих глюкозу, т.е, нечувствительного к глюкоэной катаболитной репрессии и обладающего конститутивным типом синтеза фермента.Штамм Напзепца ро)уаогрЬа КСАполучен из штамма 22 ец) генетической линии (Шеффилдский университет, Англия), который хранится в музее Львовского отделения Института биохимии им. А.В.Палладина, путем направленного мутагенеза под воздействием УФ-лучей. При мутагенезе ис, Я 1832128 А 1(57) Использование: в биотехнологии, а именно в микробиологической промышленности, и касается штамма-продуцента алкогольоксидазы с конститутивным типом синтеза этого фермента. Сущность изобретения: получен штамм Напзепц)а роугпогрЬа В КПМУ 1345 нечувствительный к глюкозной катаболитной репрессии и не требующий для экспрессии гена алкогольоксидаэы индуктора (т,е. обладающего свойством конститутивного синтеза фермента при росте на среде с глюкозой). Штамм продуцирует при росте на среде с глюкозой алкогольоксидаэу с активностью около 0,20-0,25 мкмоль/мин на 1 мг сухой массы клеток или 1,5 - 1,8 мкмоль/мин на 1 кг белка в бесклеточном экстракте,пользуют дозу, обеспечивающую 10")ь-ное выживание клеток. Отбирают мутанты исходного штамма, резистентные при росте в среде с 1 ф-ным метанолом к 2-дезоксиглю- О козе (20 мг/л) и дающие блее высокий уро- ЬЭ вень алкогольоксидазы при росте в среде с ф 1 О-ной глюкозой. ЬдПолученный штамм дрожжей Напзепц)а Ср ро)упогрЬа КСАдепонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов при ВНИИГенетика под номером; фВ КП МУ Штамм Налзепц)а ро)угпогрЬа КСА(ВКПМУ) характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками,Культурально-морфологические признаки."д 0,15 т С 55 Вегетативные клетки при выращиваниина сусло-агаре плотность о 8 Б при 37 С втечение 2 - 3 сут имеют круглую форму илиовальную размером (1,5-4,6) х (1,9 - 5,3) мкм,Клетки одиночные, редко встречаются небольшие скопления иэ 2 - 3 клеток. Размножение почкованием. В основномрасположение почек апикальное. Мицелийили псевдомицелий культура не образует,капсула отсутствует, Включения при просмотра в световом микроскопе выраженыслабо. Реакция с диаэонием синим отрицательная.На сусло-агаре после 2 - 4 сут культивирования при 27, 30 и 37 С колонии и штрихсветло кремовые, выпуклые, блестящие сровными краями, сметанообразной консистенции, легко снимается петлсй,В жидкой среде при выращлвании нэсолодовом сусле плотностью 8 Б при 37 С встатических условиях на 2 - 3 сут образуетсякольцо и островки очень тонкой пленки, азатем осадок клеток слегка кремового цвета. Гри выращивании культуры в указанныхусловиях на качалке рост отмечается в видепомутнения среды,Культура способна к спариванию и споруляции,Физиолого-биохимические признаки,Аэроб.Температурный диапазон роста 10 -42 С, оптимальная температум 37 С,Оптимум рН для роста 5,5. Культура растет в присутствии 1 М сорбита, В среде с10 ЫаС рост слабый,Чувствителен к циклогексимиду, антимицину Л, нистатину. Резистентен к ампицилли ну, тет ра ци кл и ну.Отношение к источникам углерода: хорошо утилизирует глюкозу, мальтозу, рибозу, эритрол, рибитол, глицерин, этанол,метанол,маннит, плохо утилизирует ксилозу, сахарозу, рамнозу, лимояну,о кислоту,янтарную кислоту, не утилизирует галактозу, лактозу, оаффиноэу, арабинозу, крахмал.Как источники азота хорошо усваиваетсоли аммония и нитраты,Рост штамма в синтетических средахабсолютно зависит от наличия биотина, тиамин частично стимулирует рост,Клетки штамма не содержат плазмид. %ГЦ пар составляет 48/О.Штамм не токсичен в опытах нэ белыхмышах.Штамм хранится на скошенном суслоагаре при 4 С, пересевы следует производить через 3 - 4 мес.Штамм отличается от исходного илиблизких штаммов способностью синтезировать алкогольоксидэзу при росте на среде с 5 10 15 20 25 30 35 40 гл:окозой, т.е. не чувствителен к глюкоэной кэтаболитной репрессии и не требует метанола как индуктора(другими словами, обладает способностью к конститутивному синтезу алкогольоксидазы). Продуктивность штамма на среде с глюкозой составляет 0,20-0,25 мкмоль/мин на 1 мг сухого веса клеток или 1,5 - 1,8 мкмоль/мин на 1 мг белка бесклеточного экстракта,Сущность изобретения поясняется конкретными примерами использования штамма Напзепаа роуптогрта КСА(ВКПМ М У).П р и м е р 1. Штамм выращивают до поздней зкспоненциальной или начала стационарной фазы (биомасса 1,3 - 2,0 мг/сухого веса клеток в 1 мл) в среде следующего состава (иэ расчета на 1 л среды), г: КН 2 Р 04 1 г; (МНт)2504 3,5;МцЯ 04 7 Н 20 0,5; СаС 2 0,1; дрожжевой экстракт 0.5 г; глюкоза 10 г. Культивирование ведут на качалке (200 об/мин) при 30-37 С в течение 2-3 сут. Клетки осаждают центрифугированием, промывают водой и хранят на холоду, Биомассу (в мг сухого веса в 1 мл определяют фотометрически с предварительной гравиметрической калибровкой.Активность алкогольоксидазы определяют в пермеабилиэированных дигитонином (1 мг/мл, 15 мин при 30 С) клетках следующим образом.В субстратную смесь состава 0,3 мМ о-дианизидин в 100 мМ фосфатном буфере, рН 7,5 - 2,5 мл, 0,10 раствор пероксидазы хрена (ВЕ = 0,6 "Реанал") 0,2 мл, суспензия пермеабилизованных и отмытых клеток (с = 0,2-0,5 мг/сухого веса в 1 мл) - 0,15 мл прибавляли 0,15 мл 200 мМ метанола (запуск реакции), Смесь инкубировали при 30"С 5 - 20 мин и реакцию останавливали прибавлением 0,8 мл конц. НС 1, Пробы центрифугировали (3 тыс, об/мин 5 - 10 мин) и супернатанты фотометрировали в 1 см-кюветах при 525 нм против контроля, несодержащего метанола. Удельную активность алкогольоксидэзыв мкмоль/мин на 1 мг сухого веса клетокрассчитывали по формуле где О - оптическая плотность пробы при 525нм;т - время реакции, мин;С - исходная концентрация суспензиипермеабилизованных клеток мг/мл;и - разведение этой суспенэии переданализом алкогольоксидэзы;1832128 Составитель И, ПриваловаТехред М.Моргентал Корректор Л, Филь Редактор Заказ 2604 Тираж ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 0,15 - объем вносимой в реакционную смесь суспензии клеток, мл;0,284 - калибровочный коэффициент.Продуктивность штамма (т.е, активность элкогольоксидазы) в данных условиях 5 выращивания составила 0,180-0,200 мкмоль/мин на 1 мг клеток, что в 2000 рэз выше, чем в случае штамма-прототипа 1031 Р, р пов, выращенного на глюкозной среде.П р и м е р 2. Условия выращивания - кэк 10 в примере 1, Отмытые клетки(концентрация 50 - 100 мг/мл) дезинтегрируют при 1000 об/мин с помощью стеклянных бус Я 0,45- 0,50 мм в соотношении 1.5:1 на протяжении 5 мин при охлаждении. Бесклеточный экстракт отделяют от клеточных осколков центрифугированием при 1200 об/мин в течение 0,5 ч. Определяют содержание белка в экстракте по методу Лоури и активность алкогольоксидазы, как описано в примере 1, в случае пермеабилизованных клеток. Активность алкогольоксидазы 1,5-1,8 мкмоль/мин на 1 мг белка.Формула изобретения Штамм метилотрофных дрожжей Напвепца роугпогрпа ВКПМ У- продуцент алкогольоксидазы на среде с глюкозой