Способ выделения днк-полимеразы tru из биомассы бактерий микроорганизма jнеrмus ruвеr вкм 1258

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕ СКИХРЕСПУБЛИК 12 АЗ(55 С 12 й 9/12//(С С 12 В 1/100) 9/1 АНИЕ ИЗОБРЕТЕН К ПАТЕНТ А. Г., ГородецДНК-полимемофильнойхимия, т. 47,С) М 6 д ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИПРИ ГКНТ СССР(56) Каледин А. С., Слюсаренкокий С. И. Выделение и свойстваразы из экстремально-тебактерии ТЬегп)цз гцЬег. - Бивып, 11, с, 1785 - 1791, 1982. 54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК-ПОЛИМЕАЗЫ Тгц ИЗ БИОМАССЫ БАКТЕРИЙ МИКООРГАНИЗМА ТНЕЯМОЯ ВОВЕК ВКМ 258 Изобретение относится к молекулярнойбиологии, касается выделения ферментаДНК-полимеразы и может быть использовано в генной инженерии,Цель изобретения - упрощение процесса, увеличение удельной активности и выхода Фермента,Способ заключается в культивированииштамма бактерий рода ТЬегпщз гцЬег ВКМ1258 на жидкой питательной среде, содержащей источник углерода, азота и минеральные соли, до поздней логарифмическойфазы при 55 - 70 С с последующим выделением и очисткой целевого фермента колоночной хроматографией при линейномградиенте 0-0,8 М йаС последовательно наКМ-Тоеперле, ДЭАЭ-Тоеперле и гепаринсефарозе,П р и м е р, Для осуществления ростакультуры ТЬег(т(цз гц Ьег В КМ 1258 подготавливают питательную среду, содержащую в 1(57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в генной инженерии. Цель изобретения - упрощение процесса, увеличение удельной активности и вь:хода фермента. Способ заключается в получении биомассы ТЬегпщз гцЬег ВКМ 1258, разрушении клеток ультразвуком, отделении дебриса ультрацентрифугированием, фракционировании сульфатом аммония в интервале 35 - 75% насыщения и колоночной хроматографии, осуществляемой последовательно на КМ-Тоеперле, ДЭАЭ-Тоеперле и гепарин-сефарозе в линейном градиенте ИаС 0 - 0,8 моль, Степень очистки ДНК-полимеразы Тгц 11800 раз, выход по активности 66,6%, удельная активность 22000 ед/мг белка. л; 200 г картофельного отвара, 5 г пептона и 1 г дрожжевого экстракта, остальное водопроводная вода (рН среды 8,0), Рост производят при 60 С в качалочных колбах обьемом 2 л, 120 - 150 об/мин в течение 16 ч до поздней логарифмической фазы. Клетки собирают центрифугированием при 4000 об/мин с 6000 9 в течение 10 мин с 1 л среды 7 г биомассы. Суспендируют в буфере ЕВ следующего состава: 10 мМ трис-НС(, рН 7,5, 5 мМ 2-меркаптоэтанол, 0,5 мМ ЭДТА, 0,4 М ИаС(, 25 мкг/мл РМЯГ (фенилметилсульфонилфторид). Разрушают клетки ультразвуком (22 кГц 10 раз по 1 мин, мощность тока 100 мА).Центрифугируют при 40000 об/мин 1,5 ч с 105000 9, Супернатант разбавляют в два раза 10 мМ трис-НС рН 7,5 и осаждают белок (ИН 4)рЯО( в интервале 35-75% насыщения за 30 мин при т = 4 С, центрифугируют 20 мин 15000 об/мин с 20000 9, Осадок1701112 Составитель В. ВарламовТехред М.Моргентал Корректор М, Максимишинец Редактор О. Головач Заказ 4480 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул,Гагарина, 101 растворяют в буфере А, содержащем 10 мМК-фосфата рН,5, 0,5 мМ ЭДТА, 5 мМ 2-меркаптоэтанола, диализуют против этого жебуфера (12 ч) и наносят на колонку с КМ(карбоксиметил)-Тоеперлом, 5Элюируют буфером А. Белок, не связавшийся с сорбентом, собирают при помощиспектрофотометра при длине волны 280 нм,Эту Фракцию диализуют против буфераВ, содержащего 10 мМ трис-НС рН 7,5; 0,5 10мМ ЭДТА, 5 мМ 2-меркаптоэтанола, и наносят на колонку с ДЭАЭ-Тоеперлом 650 моль.Элюируют 0-0,6 моля КО (линейный градиент), Тестирование ДНК-полимеразной активности выделенного фермента на 15матрицах ДНК-типа проводят в 50 мкл инкубационной смеси, содержащей; 25 мМ трисНО рН 9,0, 15 мМ КО, 5 мМ МдС 2, 1 мМ2-меркаптоэтанола, 10 нмоль б КТР (1 мк Кц( Н 1 00 ТР) и 140 мкг/мл активированной 20ДНК. Тестирование проводят при 70 С втечение 30 мин,За единицу активности принимают такое количество фермента, которое катализирует включение 10 нмоля 25и редшественников в кислотонерастворимый продукт на 30 мин в стандартных условиях инкубации.Фракции, содержащие ферментативную активность, объединяют и диалиэуют 30против буфера В на колонку с гепарин-сафарозой 4 В, Злюируют линейным градиентом0 - 0,8 йаО.Фракции тестируют так же, как и послеколонки с ДЭАЭ-Тоеперлом. Активные 35фракции объединяют и диализуют противбуфера С, содержащего 10 мМ Трис-НО рН7,5, 100 мМ КС 1, 10 мМ ДТТ, 0,1 мМ .ЗДТА,500 глицерина, до концентрации 1ед.акт/мкл, и хранят при 20 С, 40Полученный фермент ДНК-полимеразыТгц и имеет следующую характеристику: молекулярная масса 70000 дальтон (+1,5 Я рН оптимум 9,0 + 1,0; рН стабильность 7,5-12,0(сперминмМ, спермидин 100 мМ, алкалоид кураре 20, фторид натрия йаГ 50 мМ)Фермент проявляет резистентность кЯН-реагентам,Температурный режим 50-80 С. Температурный оптимум 68 - 70 С. Термостабильность: 90 исходной активности последвухчасовой преинкубации при 70 С,Оптимум моновалентных катионов: Каи К 0015 М,Оптимум дивалентных катионов; М 9 иМп и 0,15 мМ соответственно.Изоэлектрическая точка: 8,2 + 0,1 (изоэлектрофокусировка).Константа Михаэлиса: для ОЙТР 63мкМ,Фермент не содержит эндо- и экзонук- Глеазных активностей,Степень очистки ДНК-полимеразы Тгцсоставляет 1180 раз, выход по активности66,6%, а получаемая удельная активность22000 ед акт/мг белка,Формула изобретения Способ выделения ДНК-полимеразы Тгц из биомассы бактерий микроорганизмов ТЬегацз гцЬег ВКМ 1258, предусматривающий разрушение клеток ультразвуком, отделение дебриса ультрацентрифугированием, фракционирование сульфатом аммония в интервале 35 - 75% насыщения и колоночну 1 о хроматографию в линейном градиенте ИаО 0-0,8 моль, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью упрощения процесса, увеличения удельной активности и выхода фермента, колоночную хроматографию осуществляют последовательно на КМ-Тоеперле, ДЭАЗ-Тоеперле и гепарин-сефарозе,