5-(тозилглицил-l-пролил-l-аргинил)аминонафталин-1 метилсульфонамид в качестве анса субстрата для определения тромбина

(з С 07 К 5/06,1 ТНОЕ ГОСУДАРСТВЕНЮЕ ПВЕДОМСТВО СССРОСПАТЕНТ СССР) зсмкьЩЦ ОБ ТЕН ЛЬСТВ области бионо к новому у аминонафк 5-(тозилглинафталинся поиск в ых проиэмидов нощих при СА-субстраС) О овы минон ачест ид 5- онам карбоют в 10 сухого локс творя 0 мл ОПИСАНИЕ К АВТОРСКОМУ СВИ(71) Институт биохимии АН Литвы и Институт молекулярной генетики АН СССР(54) 5-(ТОЗИЛГЛИЦИЛ-) -ПРОЛИЛ-(-АРГИН ИЛ)А МИН ОНАФТАЛ И Н-МЕТИЛ СУЛ ЬФОНАМИД В КАЧЕСТВЕ АНСА-СУБСТРАТА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТРОМБИНА Изобретение относится к органической химии, а имен пептидильному производном талинсульфамидов.конкретно цил-пролил-аргинил)амина -метилсульфонамиду формулыТОЬ-Я -РТО-АГ(-МН который может быть использован в химиидля получения искусственного хромогенного субстрата и в биохимии для определениятромбина методом АН СА-анализа. 825800 А 1(57) Использование; в биоорганической химии в качестве АНСА-субстрата для определения тромбина. Сущность изобретения: 5-(тозилглицил- -пролил-) -аргинил)-аминонафталин-метилсульфонамид, Реагент: Тозилглицил-) -пролин, Реагент П; дигидрохлорид 5-аргиниламинонафталин-метилсульфонамида. Процесс ведут в диметилформамиде в присутствии 1-гидроксибензотриазола и дициклогексилкарбодиимида при охлаждении, с последующей нейтрализацией триэтиламином, разбавлением водой, экстракцией, упариванием, Выход 82%. Сз 1 Н 40 И 60752, т.пл,184-195" С. (ао - 8,7 (С=1, СНзОН), Апах 254 нм,Целью изобретения являетряду эамещенных пептидильнводных аминонафталинсульфавых соединений, позволяюиспользовании их в качестве АНтов определить тромбин.Поставленная цель достигается н5-тозилглицилпролил-)-аргинилаафталин-метилсульфонамидом в кАНСА-субстрата,Изобретение иллюстрируется прими.а П р и м е р 1, Дигидрохлораминонафталин-метилсульф З,З г (10 ммоль) Г 4-трет-бут ил аргинина (моногидрат) расмл сухого ДМФА, заливаюттолуола. Раствор упариеают при пониженном давлении до 10 мл, охлаждают до 10 С, добавляют 0,8 м (10 ммоль) сухого пиридина и 2,7 мл (15 ммоль) ди-трет-бутилпирокарбоната, Перемешивают 1 ч, добавляют порциями в течение 40 мин 2,6 г (11 ммоль) 5-амино нафталин-метилсул ьфонамида. Перемешивают 3 ч при 20 С, после чего добавляют 1,3 мл (7 ммоль) ди-трет-бутилпирокарбоната и перемешивают еще 16 ч при 20 С. Реакционную смесь выливают в 100 мл сухого эфира, перемешивают 10 мин, эфир декантируют, остаток заливают 50 мл смеси трифторуксусная кислота - хлористый метилен (1;1) и перемешивают 2 ч при 20 С, концентрируют до 10 мл и заливают 100 мл сухого эфира. Образовавшийся продукт отсасывают, сушат, растворяют в 20 мл воды, отфильтровывают непрореагировавший аминонафталинсульфаглид, Водный раствор экстрагируют 80 мл н-бутанола, органический слой отделяют, промывают 5 - ным чаНСОздо рН 7-8(водного слоя), затем водой (2 х 10 мл), концентрируют до 15 мл и насыщают сухим НС, Растворитель упаривают, остаток растирают с эфиром, образовавшийся осадок отсасывают и сушат, Получают 4,3 г (93; целевого продукта, т.пл. 181-190 ОС, йг=0.44 (БЦВ 412), 1 ао 2 -7,9 (С ; С НзО Н) П М Р (Д М С О): 2,38(С Н з).Найдено,; С 43,58; Н 5,75; й 18,32; Я 7,03; С 15,56,С 17 Н 26 М 650 зС 2,Вычислено, %: С 43,87; Н 5,63; М 18,06;5 6,89; С 15,24.П р и м е р 2. 5-(тоэилглицил- -пролил -аргинил)аминонафталин-метилсульфонамид.0,33 г (1 ммоль) тозилглицил- -пролина, 0,14 г (1 ммоль) 1-гидроксибенэотриазола и 0,27 г (1,3 ммоль) дициклогексилкарбодиимида смешивают, добавляют 7 мл охлажденного до -20 С сухого диметилформамида, перемешивают на ледяной бане 0,5 ч. Растворяют 0,47 г (1 ммоль) дигидрохлорида 5-аргиниламинонафталин-метилсульфонамида, полученного в прим. 1, в 4 мл диметилформамида, раствор добавляют в реакционную смесь, перемешивают на ледяной бане еще 0,5 ч. Добавляют триэтиламин до рН 7, перемешивают еще 16 ч. позволяя реакционной смеси нагреться до 20 С, отфильтровывают выпавший осадок; реакционную смесь выливают в 100 мл воды, Полученную суспензию экстрагируют четырежды по 10 мл смеси этилацетат-бутанол (1;1), органический слой отделяют и промываю 1 трижды по 5 мл 5%-ным водным ЦаНГО,1, 10".ныгл К 50 и водой г;и 1 лп 51015 55 20 25 30 35 40 45 ритель р аривают, оставшийся маслообраз.ный остаток растирают с сухим эфиром, отфильтровывают, промывают эфиром, сушат.Получают 0,57 г (827 ь) целевого продукта,т.пл, 184-195 С. Рг=0,46 (БУВ 412), арв8,7 (С; СНзОН),Найдено,: С 55,21; Н 6,13: М 12.18;5 9,71.СЪ 1 Наоч 607)2.Вычислено, %: С 55,34; Н 5,99; М 12,49;5 9,53,ПМР (ДМСО)Тое- Сург о-АгНМ(офЬО ннз 1,74 (м, 4 Н, 2 СН 2), 1,83 (м, 4 Н, 2 СН 2), 2,28 (с, ЗН, СНз), 3,25 (м, 2 Н, СН 2), 3,39(м, 2 Н, СН 2).3,61(р,2 Н, СН 2),4,13(м, 1 Н, СН),4,46(м, 1 Н, СН), 7,28 (д, 2 Н. 2 СН-ароматические), 7,64 (р, 2 Н, 2 СН-ароматические), 5,30-8,72 (14 Н, 6 Н- нафталин, 8 Н-)чН).П р и м е р 3. Анализ тромбина,К 0,3 мл субстратной смеси, содержащей по 3,5 О.Е. (Л=ЗОО нм)/мл: 5-(Й -тоэилглицил- -пролил- -аргинил)аминонафталин -1-(н-бутил)сульфонамида и -метилсульфонамида, 0,1 О,Е, (Л =340 нм) данзилвалина (внутренний стандарт) в 0,05 М трис-НС буфера рН 7,4 10,икл водного раствора тром- бина, перемешивают, инициируют 2 мин при 37 С, добавляют СНзСООН до рН 4,3, перемешивают; добавляют 0,5 мл смеси этилацетат-гексан (2:1), опять перемешивают, верхний слой отделяют, высушивают, остаток растворяют в 0,05 М ацетата аммония в 35 ацетонитриле, хроматографируют на колонке ЛогЬах С(4,6 х 250 мм) при 40 С и скорости потока 1 мл/мин и определяют 5-аминонафталин-сульфонамиды по максимуму поглощение при Л =254 нм, При завершении ферментативной реакции пик исходного субстрата исчезает (99 о ) и одновременно появляются пики продуктов ферглентативного гидролиэа 5-аминонафталин-(н-бутил)-сульфонамида и -1-метилсульфонамида, Времена удерживания 8,3 мин и 2,3 мин, соответственно,В таблице представлены результаты эксперимента, подтверждающие линейную зависимость определяемых количеств отщепленного аминонафталин-(4-метил)сульфамида от количества троглбина Исходный раствор ферглен га П.26 мг/мл бычьего тромбина. Время инкубации 12 мин, темпераура 37" С, В д . гния по поглощению Л=254 нм1825800 т БОК-.-Агц.ОНН 20(т. БОК)20,АНСА (Ме)9 З% НС2 НОН- -Агц-АНСА (Ме)Тозу-.-Рго-ОН, 1-оксибензотриаэол,дициклогексилкарбодиимид, тризтиламин82Тозу-РгоАгд-АНСА (Ме) ТОЬ - ЯЦ-Р 1 О-А 9- й Ьо, НСн Составитель А. Палэй Техред М. Моргентал Корректор И. Шул дак Заказ 2306 ВНИИПИ Тираж Подписноерственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва. Ж, Раушская наб., 4/5 г. Ужг ьский комбинат "Пат.Гагарин роиэводс;денно.и Ниже представлена схема синтеза Для ТСХ использованы пластинки ЯМо ОЧ, спектры ПМР сняты на спектрофотометре "НтасЮ Р" (90 МГц, Япония), углы вращения измерены на поляриметре фирмы Бекман, ВЭЖХ - на хроматографе фирмы Дю Пон (США),Формула изобретения 5(Тозилглицил-:пролил- -аргинил)аминонафталин-метилсульфонамид формулы в качестве АНСА-субстрата для определе 10 ния тромбина.