Штамм бактерий viвriо наrvеyi продуцент рестриктазы vна 464 i

/14,(53)5 С ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ К ПАТЕНТ е обьединение ки СО АН СССР, Н,И.Речкуно- робьева еобьединение иэики СО АН гезтг 1 с авшие,938. (54) Ш ПРОД хранится во Всекроорганизмовтрационным но - а ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОВЕДОМСТВО СССР"Вектор" и Институт биофСССР таоц "ВоаЬз", ОЗА, 1988/1989.ЬТепеас Р,В., Вгоччп Й,1, ТЬгеетоп елбарсеазез АпаЬаепа Фоз. Оеп. М 1 сгоЬо. 1985, ч, 131, р, 931ТАММ БАКТЕРИЙ ЧВйО НАЯЧЕУ -УЦЕНТ РЕСТРИКТАЗЫ ЧНА 464Изобретение относится к биотелнол гии игенной инженерии, в частности к получе;.ию штамма продуцента эндонуклеаэы рестри "ии, узнающей и расщепляющей последов,:, ьность нуклеотидов 5-СтТААО.Цел:;" изобретения являе.:я выявление штг а-продуцента, синтезирующего энло:ук., эу рестрикции, способную узнавать г р;:щ",ять.-:-;1 едовае;ьнъ;ть нук леот.ов 5- ГААС, с повыш;.нным выходом цРэевого фермента, без ин ерферирующи:. якгивностей,Это достигается получением штамма ЧЬГ 1 о Ьагчеу ВКМ ВД - продуцента эндонуклеазы рестрикции ч 1 а 464 1,Новый штамм выделен из морской воды в результате система г ическо о поиска продуцентов эндонуклеаз рестрикции, используя экспресс-метод,(57) Использование: биотехнология и генная инженерия, Сущность изобретения: выявлен штамм-продуцент ЧЬг 1 о Ьагчеу 1, синтезирующий эндонуклеэзу рестрикции.способную узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5-СТТАА 6-3, Штамм выделен в результате поиска штаммов-продуцентов эндонуклеаз рестрикции в морской воде и хранится во Всесоюзной коллекции микроорганизмов ИБФМ под регистрационным номером ВКМ ВД.Штамм продуцирует единственную рестриктаэу ЧЬа 464 1, имеющую сайт узнавания, идентичный рестриктазе Ай 1, и может полностью заменить прототип во всех генно-инженерных работах, Выход фермента ЧЬа 464 1 составляет 5000 ед/г сырой биомассы, 1 ил,Штамм депонирован исоюзной коллекции миИБФМ АН СССР под регисмаро.ВКМ В 1833 Д.Фермент Р 1 зван ЧЬа 464согласно общеп ри Гятой номенклатуре.Штамм Ч 1 ЬГ 1 о Ьагчеу 1 обладает следующими признакамиКультурально-морфологические признаки. Клетки представляют собой короткие изогнутые палочки размером 0,5 - 1,0 в ширину и 2,3 - 2,5 мкм в длину, расположенные одиночно, обладают полярно расположенным шгутиком, Подвижны, не образуют эндопор. Хорошо растет на обычных питательных средах(СПА, МПБ) при температуре 30 С. Колонии на СПА округлые, края ровные, четкие.Физиолого-биохимические свойства, Грамотрицателен, чувствителен к О/129,разжижает желатину, не выделяет сероводород, оксидаэоположителен, обладает слабой люминесценцией,Хранение штамма осуществляют под .вазелиновым маслом или в 30 глицерине 5приС.Биотехнологические.свойства. При исследовании разрушенной биомассы в ней обнаружена и выделена эндонуклеазарестрикции ЧЬа 464 , споСобная узнавать и "0расщеплять последовательность нуклеотидо в 5-СТТААО,Определяющими отличиями предлагаемого штамма ЧЬго Ьагчеу являются:штамм содержит одну рестриктаэу ЧЬа 15464вместо трех в прототипе,продуктивность штамма составляет5000 ед/г (более чем в 15 раз выше, чем уштамма-прототипа).На чертеже представлена электрофореграмма продуктов гидролиза ДНК фагаферментами А 1и ЧЬа 464 .1-ая дорожка - гидролиз Ат2-ая дорожка - совместный гидролиз АЛи ЧЬа 464253-ая дорожка - гидролиз ЧЬа 464 ,П р и м е р 1. Получение биомассы ивыделение фермента.Перед началом работы клетки штаммапродуцента пересевают бактериологической петлей на агаризованную среду (наоснове 3,50 рыбного гидролизата), содержащего 2% йаС. Чашки Петри помещают втермостат на 30 С, После 10-16 часовой инкубации подросшие клетки пересевают в 35колбы со свежей питательной средой, состоящей из (г/л): рыбный гидролизат 35, хлористый натрий 20 и помещают в термостатированную качалку, Культивируют при температуре 30 С, при 150 об/мин до достижения стационарной фазы роста. Клеткиосаждают центрифугированием при 4 С.Выделение осуществляют по методикеВсйе, Рготта, гпЬег 4), Выход ферментасоставляет 5000 ед/г сырой биомассы. Фермент хранится при -20 С в глицерине,П р и м е р 2. Определение специфичности и активности фермента,Специфичность фермента определяют по картине совместного и параллельного гидролиза субстратной ДНК (фиг. 1). Идентичность картин гидролиза на 1-3 дорожках говорит о том, что эти ферменты узнают и расщепляют одинаковую последовательность нуклеотидов 5-СТТААО.Выход фермента ЧЬа 464определяют по электрофоретической картине гидролиза ДНК фага лямбда, За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДНК фага лямбда в течение 1 ч при температуре 37 С. Выход фермента составляет 5000 ед/г, активность - 5000 ед/мл.Полученный штамм обладает следующими преимуществами по сравнению с известными штаммами:содержит единственную эндонуклеаэу рестрикции ЧЬа 464 ,имеет продуктивность, более чем в 15 раз превышающую штамм-прототип,не требует специального оборудования для культивирования,неприхотлив к питэтельным средам, Поскольку эндонуклеаза рестрикции ЧЬа 464имеет сайт узнавания, идентичный сайту Ай , а выход фермента более высок, то ЧЬа 464может заменить прототип во всех генно-инженерных работах,Изошизомеры фермента АЛв СССР до сих пор не найдены, Поэтому производство эндонуклеаэы рестрикции ЧЬа 464позволяет полностью отказаться от закупок фермента за рубежом,Внедрение штамма планируется в НИКТИ биологически активных веществ НПО "Вектор" в 1991-1992 годах.В настоящее время рестриктаэа ЧЬа 464 , полученная из ЧЬго Ьагчеу, используется для выполнения различных тем НИР во ВНИИ молекулярной биологии и НИКТИ биологически активных веществ НПО "Вектор", в Новосибирском институте биоорганической химии СО АН СССР,Формула изобретения Штамм бактерий ЧЬго Ьагчеу ВКМ В 1883 Д - продуцент рестриктазы ЧЬа 464 ,Составитель В, Репи Техред М,Моргентал Корректор М. Петров ктор роизводственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 10 акаэ 965 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5