Штамм бактерий micrococcus species продуцент рестриктазы msp 20 i

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИК 180619 5 С 12 Й 9/14, 1 ТЕН ТЕНТ в 5-ТООСС фермент достигаетсцз зрес 1 е донуклеаз леотидо целевогоЭто М 1 сгосос цента эн ся получение э ВКПМ Вы рестрикции штамма- проду-зр 20. леего на 201 с ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНВЕДОМСТВО СССР1 ГОСПАТЕНТ СССР).1, Мо 1. В 1 о. 1977, ч, 114, М 3, р, 433 - 440,Ро 01 зоп С, Мзс, а туре 11 гез 1 г 1 сбопепс 1 опцс 1 еазеэ агою Мсгососсцэ зрес 1 езаЫсЬ гесоцплез 5-ТООССА, йцс 1, Ас 1 бзВез, 1989, р. 5858,Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии, в частности к получению штамма продуцента эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5- ТООССА. Эндонуклеаза данной специфичности может быть использована для работ по клонированию, физическому картированию генов. Данная эндонуклеаза является удобной моделью для изучения специфичности белок-нуклеиновых взаимодействий.Целью изобретения является выяв ние штамма-продуцента, синтезирующ зндонуклеазу рестрикции, способную уз вать и расщеплять последовательность нук(54) ШТАММ БАКТЕРИЙ М 1 СВОСОССОЯ ЯРЕС ЕЯ - ПРОДУЦЕНТ РЕСТРИКТАЗЫ Мвр 201(57) Использование; биотехнология и генная инженерия. Сущность изобретения, штамм бактерий М 1 сгососсцв зрес 1 ез, хранящийся в ВКПМ ВНИИ генетика под регистрационным номером В, получен в результате систематического поиска продуцентов эндонуклеаз рестрикции как контаминант при культивировании. При выращивании штамма на свежей. питательной среде при 30 С в термостатированных качалках до достижения стационарной фазы роста получают урожай клеток, из которых выделяют фермент Мзр 201, способный узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5- ТООССА, Рестриктазу данной специфичности применяют в генетической инженерии для создания рекомбинантных молекул и для создания физического картирования молекул ДНК. 1 ил,А, с высоким выходом Новый штамм выделен как контаминант при культивировании в результате системаического поиска продуцентов эндонуклеаз рестрикции, используя экспресс-метод,Штамм депонирован и хранится во Всеоюзной коллекции промышленных микрорганизмов ВНИИ генетика под номером ВКПМ В.Фермент назван Мэр огласно общепринятой номенклатуреШтамм М 1 сгососсцз зрес 1 ез обладает следующими признаками,Культурально-морфологические признаки. Клетки сферические, размером 0,5- 0,7 мкм в диаметре, расположенные одиночно, в парах, тетрадах или неправильных скоплениях. Неподвижны, не образуют эндопор, Хорошо растут на обычных питательных средах (СПА, МПБ) при температуре ЗОС, Колс 1 нии на СПА опаковые, желтоватые, округлые, край ровный.Физиолого-биохимические свойства. Аэроб, отрицателен по оксидазе, амилазе, аргининдегидролазе и реакции с метиловым красным, не выделяет сероводород и индол, каталазоположителен, не утилизирует малонат, цитрат, мочевину, не восстанавливает нитраты,Содержание ГЦ пар в ДНК - 77 мол. ф, Хранение штамма осуществляют под вазелиновым маслом или в 30 глицерине приС,Выходрестриктазы Мзр 201 3000 ед/г сырой биомассы,На чертеже представлена злектрофореграмма продуктов гидролиза ДНК фага лямбда ферментами Ваи Мзр 201,1-ая дорожка - гидролиз Ва 12-ая дорожка - совместный гидролиз Ва 1 1 и Мзр 20 13-ая дорожка - гидролиз Мзр 201 П р и м е р 1. Получение биомассы и выделение фермента,Перед началом работы клетки штамма продуцента пересевают бактериологической петлей на агаризованную среду, Чашки Петри помещают в термостат на 30 С. После 10-12 часовой инкубации подросшие клетки пересевают в колбы со свежей питательной средой, состоящей из (г/л): бактотриптон - 10, дрожжевой экстракт - 5, хлористый натрий - 10 и помещают в термостатированную качалку.Культивируют при температуре 30 С, при 200 об/мин до достижения стационарной фазы роста, Клетки осаждают центрифугированием при 4 С. Выделение осуществляют по методике ВсИе, Р 1 гоца, 1 глЬег(4). Выход фермента составляет 3000 ед/г сырой биомассы,Фермент хранится при -20 С в глицерине,П р и м е р 2. Определение специфичности и активности фермента.Специфичность фермента определяютпо картине совместного и параллельногогидролиза субстратной ДНК (фиг, 1), Идентичность картин гидролиза на 1 - 3 дорожкахговорит о том, что эти ферменты узнают ирасщепляют одинаковую последователь 10 ность нуклеотидов 5-ТООССА,Выход фермента Мзр 20 1 определяютпо электрофоретической картине гидролизаДНК фага лямбда. За единицу активностипринимают минимальное количество фер 15 мента, необходимое для полного расщепления 1 мкгДНКфага лямбда втечение 1 ч притемпературе 37 С, Выход фермента составляет 3000 ед/г, активность - 5000 ед/мл,Полученный штамм обладает следую 20 щими преимуществами по сравнению с известным:имеет продуктивность в 3 раза большую, чем штамм-прототип,не требует длительного культивирова 25 ния,Поскольку эндонуклеаза рестрикцииМзр 20 1 имеет сайт узнавания идентичныйсайту Мзс 1, а выход фермента более высок,то Мзр 20 1 может заменить прототип воЗО всех генно-инженерных работах.Иэошиэомеры фермента в СССР до сихпор не найдены. Поэтому производство эндонуклеазы рестрикции Мзр 20 1 позволитполностью отказаться от закупок фермента35 за рубежом.Внедрение штамма планируется в НИКТИ биологически активных веществ НПО"Вектор" в 1991-1992 годах.В настоящее время рестриктаза Мзр40 201, полученная иэ М 1 сгососсоз зрес 1 ез, используется для выполнения различных темНИР во ВНИИ молекулярной биологии иНИКТИ биологически активных веществНПО "Вектор", в Новосибирском институте45 биоорганической химии СО АН СССР,Формула изобретения Штамм бактерий М 1 сгососсцз зрес 1 ез ВКПМ В- продуцент рестриктазы Мзр50 201.1 В 0 6191 едак Произ аказ 965 8 НИИПИ Составитель Ю, Зернов Техред М,Моргентал Корректор С. Лисина Тираж Подписноесударственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 венно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 10