Штамм virus нератiтis а номinis для приготовления вакцинных и диагностических препаратов

.М 5 С 12 й 7/ ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНВЕДОМСТВО СССР(ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНК ПАТЕНТУ ноку-. ;ф тках О С)(71) Всесоюзный научно-исследовательский институт молекулярной биологии Научнопроизводственного объединения "Вектор" (72) А.Г,Майданюк, Е.П,Бондаренко, Ю.В.Немцов, Г,И,Тюнников, В, Б, Конакова, Н,В.Мамаева и В.Е.Чижиков(73) Всесоюзный научно-исследовательский институт молекулярной биологии Научнопроизводственного объединения "Вектор" (56) Авторское свидетельство СССР ч". 1328376, кл, С 12 й 7/00, 1987.Авторское свидетельство СССР М 1606533, кл, С 12 М 7/00, 1990. Изобретение относится к медицинской вирусологии и касается получения быстрорастущего штамма вируса гепатита А (ВГА), Этот штамм может быть использован в профилактических и диагностических целях в медицине,Целью изобретения является получение в культуре клеток быстрорастущего штамма ВГА, способного образовывать бляшки, что значительно упрощает и удешевляет работу при получении диагностических и профилактических препаратов,Штамм ВГА МБдепонирован под йг 213 в коллекции Государственного института стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов им. Л,А,Тарасевича.Штамм получен из фекалий больного с клинически выраженными признаками гепатита А в 1988 г. Приготовленную 10% сус(54) ШТАММ ЧВ.)5 НЕРАТТ 3 А НОМР 4 Я ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИННЫХ И ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ (57) Использование: медицинская вирусология. Сущность изобретения: штамм ГИСК М 213 выделен из фекалий больного и адаптирован к культуре РВГК, Инкубационный период внутриклеточного антигена наблюдается в течение 2 сутнаибольшее количество антигена отмечается на 7 - 8 сут, и составляет 1:64, Штамм обладает цитопатическим эффектом. Инфекционный титр составляет(3 - 5) 10 БОЕ/мл. Штамм ГИСК чт 213, адаптированный к диплоидным клеткам Л, обладает иммуногенной активностью. Титр антител у морских свинок с оста вл яет 1:100-1:1000. 1 табл. пензию фекалий на 0,1 М Ка-фосфатном буфере (рН 7,4) ресуспендируют, центрифугируют в течение 10 мин при 1500 - 2000 об/мин, Супернатант фильтруют через фильтр 0,22 мкм (производство М)роге), фасуют по 0,5 мл в стерильные флаконы и хранят при температуре (-70+0,5) С. Полученный супернатант используют в качестве и лята для получения штамма ВГА на кле РВй К.На сформированный монослой клеток ГВЬКнаносят инокулят. После адсорбции в сосуд добавляют ростовую поддерживаю".Ую среду, Через неделю после заражения культуральную жидкость сливают, клетки промывают раствором трипсина-версена и отслоившиеся клетки собирают в натрий-солевом фосфатном буфере, Собранные клетки трижды промораживают и клеточный лизат используют в качестве инокулята дляследующего пассажа. Уже на втором пассаже в клетках ЕВЬКвыявляется антиген.Антиген также выявляется в процессеадаптации полученного штамма к перевиваемой культуре клеток почки зеленой мартышки 4647 и диплоидной культуре клетоклегкого человека Л 68. Возможна адаптацияштамма и к другим клеточным линиям.Штамм характеризуется следующимипризнаками.Морфологические признаки, ЧастицыВГА, содержащие РНК, по данным электронной микроскопии имеют диаметр 27 нм.Основная масса частиц имеет плавучуюплотность 1,34 г/см в градиенте хлористого цезия и коэффициент седиментации 155160 520 а - в градиенте нейтральнойсаха розы,Культуральные свойства. Для культивирования штамма ВГА на клетках ЕВЪКиспользуют поддерживающую среду ИглаМЭМ, содержащую 5 фетальной сыворотки крупного рогатого скота и антибиотикипенициллин и стрептомицин по 100 ед/мл и100 мг/мл,соответственно. В качестве ростовой среды для клеток используют ту жесреду с 10 фетальной сыворотки и указанными выше концентрациями антибиотиков, Культивирование штамма ВГА МБ на клетках ЕВЬКпод покрытием, содер-жащим 5 бактоагара, на 11-12 сутки приводит к образованию четких бляшек размером1-3 мм.Реакцию нейтрализации проводят науровне пятого пассажа с нейтрализуемымотраслевым стандартным образом (ОСО ) ииммуноглобулинами, содержащими специфичные антитела к вирусу гепатита А (198),В течение 1,5 ч каждое разведение вируса вравных объемах инкубируют с эмбриональной сывороткой плодов коров, с ОСО ифракцией сыворотки реконвалесцента, содержащей иммуноглобулины класса 6(дб).Затем по 0,2 мл каждого комплекса наносятна слитный монослой клеток ЕЯЬКи инкубируют 1,5 - 2 ч при комнатной температуре,После адсорбции клетки культивируют подпокрытием, содержащим 5 бактоагара,Через 10-12 суток на монослое появляютсябляшки.В результате реакции нейтрализацииантитела, содержащиеся в ОСО и 96, нейтрализуют часть вирусных частиц в препарате, в результате чего титр вируса вобразцах, содержащих ОСО+ и 96 на порядок отличается от титра исходного вируса.При иммунизации животных очищенным вирусом отмечается нарастание специфических антител в титрах 1;100-1;1000. С целью исследования данного штаммана молекулярном уровне был проведен анализ кДНК, полученный на матрице вируснойРНК, с помощью метода амплификации5 ДНК. Затравками в процессе амплификациислужил набор олигонуклеотидов, выбранных и синтезированных на основе теоретического анализа наиболее консервативныхучастков РНК нескольких известны- штам 10 мов ВГА, Такой анализ, проведенный с по. мощью термостабильной ДНК полимеразы,обнаружил наличие небольшого фрагментаразмером около 270 н,паналогично фрагменту в составе рекомбинантной плазмиды,15 содержащей ген белка ЧР 1 вируса НА 8-15,Гибридизационный анализ этого участка ссоответствующими мечеными праймерами, а также с ник-транслированным фрагментом гена ЧР 1 в составе рекомбинантной20 плазмиды дал положительный ответ. Анализируя в ПАА-ЮЗ геле высо:.;оочищенныйВГА штамм МБ, выявили при окраске пометоду Кумасси три полипептида с относительнйм . мол. массами 34000 (ЧР 1), 2550025 (ЧР 2) и 23000 (ЧР 3).Электронна-микроскопическое исследование с помощью негативного контрастапозволило обнаружить час-,ицы вируса гепатита А в клеточном лизате, культуральной30 жидкости, сконцентрировачной в 100 раз икультуральной жидкости, очищенной в градиенте СзС.Вирусные частицы имеют типичнуюморфологию и представляют собой сфери 35 ческие частицы с диаметром 25-28 нм. Концентрация в клеточном лизате составляет10 в.ч,/мл, а в очищенной культуральной7жидкости - 10 в.ч,/мл. Следовательно, по9физико-химическим и антигенным свойст 40 вам штамм не отличается от естественногоциркулирующего в природе ВГА и штаммаНА 3-15, адаптированного к перевиваемойкультуре клеток 4647. Приведенные примеры подробно раскрывают сущность изобре 45 тения,П р и м е р 1. Получение штамма ВГАМБ.Штамм ВГА МБполучают из фекалийбольного с. клинически выраженными при 50 знаками гепатита А. Готовят 10 суспензиюфекалий на 0,1 М натрий-солевом фосфатном буфере (рН 7,4), центрифугируют в течение 10 мин при 1500-2000 об/мин.Профильтрованный через фильтр с диа 55 метром пор 0,22 мкм (МИроге) супернатантфасуют и замораживают с последующим использованием в качестве инокулята.Культивирование клеток ЕВЬКдо формирования монослоя осуществляют на среде Игла МЗМ с 10 фетальной сыворотки и1806190 Продукция антигена ВГА в клетках ЕЮК, определенная в реакции ИФАСредние арифметические значени независимым пробам в о,е,Оценка стандэргного среднеквад кого значения,внутриклеточного антигена . 1 водятся по тичного отклонения ср -днегс ифметиче антибиотиками пенициллином и стрептомицином в количестве 100 ед/мл и 100 мг/мл среды, соответственно.На предварительно сформированный слитный монослой перевиваемых клеток почки эмбриона макаки резус(РВГК) наносят профильтрованную 10 О суспензию фекалий и инкубируют при (37+0,5) С в течение двух часов. Инокулят сливают, монослой промывают раствором Эрла и добавляют поддерживающую среду, Через неделю культуральную. жидкость сливают, клетки промывают трипсином-версеном дважды и добавляют 0,1 М натрий-солевой фосфатный буфер (рН 7,4). Суспензию клеток трижды промораживают при (-70+1,0) С для более полного разрушения клеток и клеточный лизат используют в качестве инокулята для следующего пассажа,Очищенный вирус получают после трехкратного замораживания и оттаивания культуральной жидкости вместе с клетками. Дебрис удаляют низкоскоростным центрифугированием (2000 об/мин, 0,5 - 1 ч), добавляют сульфат аммония в расчете 24 г на 100 мл супернатанта, Осадок формируют в холодильнике втечение суток при(4+0,5) С, далее центрифугируют при 8000 д в течение 1 - 2 ч. Осадок ресуспендируют в необходимом объеме 0,1 М натрий-солевого буфера с рН 7,4, Вирус гепатита А осаждают через подушку 20 О раствора сэхарозы с последующим центрифугировэнием в градиенте хлористого цезия,П р и м е р 2, Культивирование штамма и получение вирусного антигена.Для культивирования штамма Ь 213 на клетках ЕВЬКиспользуют среду Игла МЭМ, содержащую 5 ф эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота и антибиотики, как в примере 1. Достаточное для определения количест.во внутриклеточного энтигена (по даннымИФА) в клетках РВЬКпоявляется уже на3 сутки (табл и ца). Наибольшее кол ичест 5 во антигена в этой системе выявляется на7-8 сутки и составляет 1;64, что сопоставимо с параметрами для системы ГВЬКНА 5-15,Особенностью заявляемого штамма яв 10 ляется способность образовывать крупныебляшки, что значительно упрощает работу,Для получения бляшек штамм культивируютна клетках ГЯЬК, Для этой цели клеткивыращивают на плоских флаконах объемом15 50 мл до формирования слитного монослоя,отмывают раствором Эрла, наносят инокулят, Через два часа монослой отмывают инаносят покрытие. В качестве покрытия используют среду Игла МЭМ, 2 фетальной20 сыворотки и 5 бактоагара. Флаконы инкубируют две недели в термостате при температуре (36,5+0,5) С, затем манослойокрашивают 0,05 раствором кристалла виолета, отмывают в течение 1 - 2 мин проточ 25 ной водой и подсчитывают бляшки.Инфекционный титр ВГА нэ уровне 5-гопассажа составляет (3 - 5) 10 БОЕ/мл,Таким образом, результаты эксперимента показали, что заявляемый штамм30 (быстрорастущий и обладающие цитопатическим эффектом) может быть использованпри получении вакцинных прчэратов, атакже при получени 1; "-игена в необходимом количес" дл и пользования в раз 35 личных тест-сис емэх. Ф о р мул а и зоб рете н и я Штамм чгаз Ьерабсз А Ьоеиз ГИСК В 40 213 для приготовления вакцинных и диагностических препаратов.