Способ получения нехолерогенных цамф-негативных вариантов холерного вибриона

(54) СПОСО НЫХ цАМ ХОЛЕРНО (57) Испол холерного сии разли бретения плаэмиды клетку хол отбор тра синтезу цА ность ю. Б ПОЛУЧЕНИЯ НЕХ Ф-НЕГАТИВНЫХ В ГО ВИБРИОНА ьзование: получен вибриона, дефектны ных признаков. Сконьюгационно кишечной палочки рного вибриона, вы сконьюгантов, не МФ и не обладающ ЛЕРОГЕАРИАНТО арственныитивочумный, . ие вариантов х по экспресущность изое введение РОА 6012 в ращивание и способных к их холерогенеева, А.Ф,Пи, МЗ, р,157 нты в моле76, с. 440. 4 м О ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(56) З.Арр 1. Вассего., 1967, ч161.Миллер Дж, Эксперимлярной генетике. М.: Мир, 1 Изобретение относится к медицинской микробиологии, к молекулярной биологии, связанной с получением вариантов, дефектных по экспрессии различных признаков.До настоящего времени неизвестны варианты холерного вибриона, дефектные по уровню внутриклеточного цАМФ. Между тем этот нуклеотид, являясь вторичным мессенджером, контролирует синтез болей 60 белков прокариотов, влияет на различные функции бактериальных клеток, включая синтез нуклеиновых кислот, различные этапы клеточного деления, проницаемость мембран, репрессию биосинтетических энзимов и регуляторных белков, репликацию плазмид и лизогенизацию бактериофагом. ЦАМФ является непосредственным участником развития патологического процесса при холере, когда при контакте вибриона с эпителием кишечника последним выбрасывается в просвет большое количество циклического нуклеотида. Это, наряду с другими факторами, по-видимому, обусловливает нарушение функций эукариотических клеток. ЦАМФ-негативный вариант может быть использован для выявления катаболитчувствительных генов холерного вибриона, изучения регуляторных процессов в клетке, связанных с особенностями биологии возбудителя, изучения механизма действия а нуклеотида при патогенезе, а также для выяснения вопросов взаимосвязи циклонуклеотида и вирулентности,Известен способ получения цАМФ-негативных вариантов бактерий (Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике.Пер. с англ.М.: Мир, 1976 с.440), предусматривающий обработку суспензии нитроэогуанидином с последующей инкубацией в бульоне в течение ночи, высев обработанной культуры на среду, содержащую тетразолий, арабиноэу, мальтозу, с последующей инкубацией в течение 18 ч: отбор и очистку окрашенных колоний, проверку колоний на способность расти на минимальном агаре с лактозой и минимальном агаре с арабинозой, мальтозой, глицерином, рамнозой и глюкозой и заключительной провер 1773940кой предполагаемых мутантов на способность расти на минимальном агаре с глюкозой и отвечать нэ добавление экзогенного цАМФ,Способ состоит из 7 этапов, требует 5 пересевов на питательные среды с добавлением различных компонентов и затраты времени - 7 дней. К тому же обработка химическим мутагеном сопряжена с неконтролируемым повреждением генома . в различных его областях, что далеко не всегда соответствует целям эксперимента и порой сильно затрудняет его толкование,Целью изобретения является ускорение способа получения цАМФ-негативных вариантов холерного вибриона ээ счет исключения возможности генетических повреждений хромосомэльного аппарата клетки.Цель достигается путем коньюгационного введения плазмиды кишечной палочки рОА 6012 (Кв, Тс, Яп, Св, Яи) в клетку холерного вибриона и высева вибрионов на селективную среду с рифампиционом и одним из следующих антибиотиков;канэмицином, стрептомицином, тетрациклином. Концентрации антибиотиков подобраны в типовых экспериментах,П р и м е р 1, Культуру донора Езсйег 1 сЮа со 653 и культуру реципиента Н 1 Ьг 1 о сЬо 1 егае стоегае ОГ, устойчивого к рифампицину. выращивали 18 - 20 ч в бульоне сердечной мышцы рН 7,6, На пластинки мясо-пептонного агара рН 7,6 высевали 0,3 мл культуры донора, а затем вторым слоем наносили 0,3 мл культуры реципиента и чашки оставляли при 37 С в течение 3 ч. Клетки смывали 5 мл физиологического раствора, полученную суспензию после соответствующих разведений высевали по 0,1 мл на мясо-пептонный агар, содержащий 100 мкг/мл рифампицина и 50 мкг/мл канамицина. Посевы инкубировали при 370 С в течение 48 ч. Выросшие трэнсконъюганты, несущие плазмиду рОА 6012, использовали для изучения содержания цАМФ и холерогенности.Исходный штамм холерного вибриона ОГ, ревертант, полученный после элиминации плазмиды рОА 6012 с помощью бромистого этидия, и трансконьюганты исследовали на содержание цАМФ.Для этого клетки высевали в 100 мл бульона Мартена рН 7,6 и выращивали при 37 С 5 ч с аэрацией до конца логарифмической - начала стационарной фазы (ОП 6 оо ни=1,2), осаждали центрифугированием при 6000 об/мин 10 мин, суспендировали в 300 мкл 50 мМтрис-НС 1 рН 7.5 с 4 мМ ЭДТА и лизировали добавлением 100 мкл5 10 20 25 30 хлороформа. Лизат осветляли при 16000 об/мин и исследовали на наличие цАМФ.Количество белка в лиэатах определяли методом, основанном на спектрофотометрировании растворов при двух длинах волн, разности в величине оптической плотности при 228,65 и 234,5 нм, Концентрация белка, вносимая в пробу при определении цАМ, составляла 60 мкг.При определении цАМФ инкубацию образцов проводили на ледяной бане в течение 2 ч. Отделение белоксвязанного цАМФ от несвязанного нуклеотида осуществляли адсорбцией свободного нуклеотидана угле марки "Норит А", для чего в каждую пробу добавляли 100 мкл угольной суспензии (2,60-ный раствор угля, 20 ь-ный раствор БСА) с последующимцентрифугированием при 10000 об/мин. Равные количества супернатанта (200 мкл) помещали во флаконы для сцинтилляционного счета и считали на жидкостном сцинтилляционном счетчике "Маг 1 2". Концентрацию нуклеотида выражали в пикомолях 1 мг белка,Трансконъюганты, несущие плаэмиду рОА 6012. при выращивании в богатой питательными веществами среде в конце логарифмической - начале стационарной фазы роста цАМФ, не синтезируют,Изучение холерогенных свойств проводили на модели кроликов-сосунков, которым под тиопенталовым наркозом вскрывали брюшную полость, извлекали петлю тонкой кишки и в ее просвет вводиливзвесь микробов. Затем петлю погружалиобратно в кишечную полость, брюшнуюстенку и кожу зашивали. Для заражения использовали три дозы микробных клеток 10, 105 и 10. Погибших и хлороформированных животных вскрывали через 48 ч, Степень холерогенности оценивали по скоплениюжидкости в проксимальном отделе толстогокишечника по четырехбальной системе, Об 45 наружено, что Н.сйо 1 егае сЬо егае 0-75 и ревертант утративший плаэмиду рОА 6012, вдозе 10 - 10 микробных клеток вызывалитбольшое скопление бесцветной жидкости впроксимальном отделе толстого кишечника,50 Все изученные трэнсконъюганты изменений в кишечнике не вызывали, Это свидетельствует о том, что несущие плазмидукишечной палочки рОА 6012 трансконъюганты полностью утрачивают холерогенные55 свойства, которые однако могут восстанавливаться после элиминации данной плазмиды,П р и м е р 2. Культуру донораЕзсйег сЫа соИ О 53 и культуру рифампицинорезистетного реципиента Н 1 Ьг 1 о сЬо 1 егае1773940 Составитель Б. МишанькинТехред М.Моргентал Корректор Н. Гунько Редактор Заказ 3908 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул,Гагарина, 101 стоегае ОГвыращивали 18-20 ч в бульоне сердечной мышцы рН 7,6. На чашкимясо-пептонного агара рН 7,6 высевали 0,3мл культуры донора, а затем вторым слоемнаносили 0,3 мл культуры реципиента ичашки оставляли при 37 С в течение 3 ч.Клетки смывали 5 мл физиологического раствора, полученную суспензию после соответствующих разведений высевали по 0,1мл на мясо-пептонный агар, содержащий100 мкг/мл рифампицина и 30 мкг/млстрептомицина. Посевы инкубировали при37 С в течение 48 ч. Выросшие трансконъюганты, несущие плазмиду рОА 6012, использовали для изучения содержания цАМФ ихолерогенности,Исходный штамм холерного вибрионаОГ, ревертант, полученный после элиминации плазмиды рбА 6012 с помощью бромистого этидия, и трансконъюгантыисследовали на содержание цАМФ,Для этого клетки высевали в 100 млбульона Мартена рН 7,6 и выращивали при37 С 7 ч аэрацией до конца логарифмической - начала стационарной фазыОПбоо н 1,5), Далее, как в примере 1.П р и м е р 3. Культуру донораЕзсЬегСЫа соП 653 и культуру рифампицинорезистентного реципиента ЧЬгостоегае еог Ивыращивали 18 - 20 ч вбульоне сердечной мышцы рН 76, На чашкимясо-пептонного агара рН 7,6 высевали0,3 мл культуры донора, а затем вторым1 слоем наносили 0,3 мл культуры реципиента ичашки оставляли при 37 С в течение 3 ч.Клетки смывали 5 мл физиологического раствора, полученную суспензию после соответствующих разведений высевали по 0,1мл на мясо-пептонный агар, содержащий100 мкг/мл рифампицина и 30 мкг/мл тетрациклина. Посевы инкубировали при 37 С в течение 48 ч. Выросшие трансконьюганты,несущие плазмиду рба 6012, использовалидля изучения; содержания цАМ Ф и холерогенности.5 Исходный штамм холерного вибрионаИ, ревертант, полученный после элиминации плазмиды рбА 6012 с помощью акридинового оранжевого и трансконьюгантыисследователи на содеражение цАМФ,10 Для этого клетки. высевали в 100 млбульона Мартена рН 7,6 и выращивали при37 С 7 ч с аэрацией до конца логарифмической - начала стационарной фазы ( ОП боо нм1,5). Далее как в примере 1,15Все полученные трансконьюганты былицАМФ-негативными и холерогенными,Таким образом, предложенный способполучения цАМФ-негативных вариантов холерного вибриона, связанных с вирулентно 20 стью, требует меньшего числа манипуляцийи меньших материальных затрат, исключаетповреждение генетической информацииклетки холерного вибриона, дает возможность в случае необходимости элиминиро 25 вать плазмиду и полностью восстановитьгенотип исходного штамма. Формула изобретенияСпособ пОлучения нехолерогенных30 цАМФ-негативных вариантов холерноговибриона путем обработки исходных клеток, холерного вибриона, выращивания и отбораклеток, не содержащих цАМФ и обладающих холерогенностью, о т л и ч а ю щ и й с я35 тем, что. с целью ускорения способа, обработку осуществляют путем совместного выращивания с клетками ЕзсЬегсЫа со,несущими плазмиду рОА 6012, выращивание проводят в бульоне из сердечной мыш 40 цы, а затем на мясо-пептонном агаре сантибиотиками,