Способ выделения фермента нейраминидазы холерных вибрионов

ОП ИСАНИНА ИЗОБРЕТЕНИЯ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(61) Дополнительное к авт. свид.ву(22) Заявлено 18.04,75(21) 2125729/28-1 51) М, Кл 8 7 Ю 2 и заявки Х с присоедиие (23) Приорит Государственный комитет Соовтв Министров СССР по делам изоорвтеннй и открытий(43) Опубликовано 25,08.77,Бюллетень М (46) Дата опубликования описания 28.09 ДК 663,5088,8)Авторыизобретени нсщтут высокомолекулярных соединений АН СССР 71) Заявите ВЫДЕЛЕНИЯ ФЕРМЕНТА НЕЙРАМИНИДАЗЬ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ мининаратнымоследуюосадка колонкенцентрадли- ыхо е выхода ь т изобретения состоит в том, альную жидкость пропускают чесильный катионит В водороднойо15-25 С, рН 5,1, колонку с каромывают 0,1-0,2 М ацетатным5,0.с добавлением хлористого сорбируют фермент с колонки фосфатным буфером, рН 6,0-6,5присутствии стабилизатора 02%-ного раствора ацетонитрила что культур рез карбок форме при ионитом п уфером, рН альция, де 0,1-0,2 М ри 5 Св 0,001-0,0 Изобретение относится к областилогии ферментных препаратов,Известен способ выделения нейрзы из культуральной жидкости трехкосаждением сульфатом аммония, с ишей экстракциейфермента водой изи ионообменной хроматографией нас ДЭНЭ-целлюлозой в градиенте коции хлористого натрия,Однако известный способ являеттельным и не обеспечивает высокогда целевого продукта 1,Цель изобретения - повышенипродукта и сокрашение времени. и из элюата гельхроматографией выделяютконечный продукт.П р и м е р 1, В ионообменпуто колонку(диаметр 1,6; высота 5,0 см) загружаюткарбоксильный катионит КМТ с коэффициентом набухания 3,2-3,4 в водородной форме,размер зерен 0,1-0,25 мм. Черс.з колонкупропускают 300 мл культуральной жидкостихолерного вибриона пои рН 5,1 со скоростью100 мл/ч, При этом нейрамининаза полностью сорбируется ца катцоните: конт;.Ольполноты сообции осуществляют по 4.ерментнойактивности нейраминидазы в культуральнойжидкости на выходе из колонки, Затем колонку промывают 0,1 М ацетатным буферомс рН 5,0 в присутствии 0,05; - ного хлористого кальция со скоростью 200 мл/ч ирпо20 С. Расход буфера составляет 120 млна колонку, Песорбцию нейраминидазы; проводят при 5 С 0,1 М фосфатным буфером вприсутствии 0,003%-ного ацетонитрила прирН 6,0 со скоростью 20 мл/ч,Выход активности нейраминидазы прц десорбации составляет 50% по сравнеспо с активностью исходной культуральной жидкости.524376 Составитель С. МалютинаРедактор В. Смирягина Техред ЗФанта Корректор И, Гоксич Заказ 3124/55 Тираж 553 Подписное ЦНИИИИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Филиал ППП "Патент"г, Ужгород, ул. Проектная, 4 3Полученный элюат концентрируют в 10 разна установке для ультрафильтрации с целлофаном в качестве фильтрующего материала,Концентрат гельхроматографируют по принципу группового разделения на колонйе ссефадексом Г, Гельхроматографию проводят в 0,85%-ном хлористом натрии в присутствии С,1%-ного хлористого кальдия. Собирают первую белковую фракцию, котораясодержит высокоактивфж нейраминидазу,Выход продукта составляет 38%.П о и м е п 2. В ионообразную колонку (диаметр 2,1; высота 8,0 см) помещаюткатионит КМТ в водородной форме с коэффициентом набухания 3,5; размер зерен0,1-0,16 мм, Через колонку пропускают600 мл культуральной жидкости холерныхвибрионов при рН 5,1 со скоростью 150 мл/ч. Нейраминидаза полностью сорбируется на катионите, о чем можно судитьпо отсутствию нейраминидазной активности в фильтрате ва в ходе из колонки. Затем колонку промывают 0,2 М ацетатнымбуфером с рН 5,0 в присутствии 0,5%-ногохлористого кальция со скоростью,100 мл/чопри 25 С. Расход буфера составляет ЗООмлна колонку данных размеров. Десорбциюнейраминидазы проводят при 5 С 0,15 Мраствором фосфатного бункера в присутствии 0,001%-ного ацетонитрила при рН 6,4со скоростью 39-45 мл/ч.Выход активности нейраминидазы при десорбции с колонки составляет 40%, а концентрирование в пике происходит в 4 разапо сравнению с активностью в исходной культуральной жидкости Полученный элюат концентрируют в 8 раз на установке для ультрафильтрации, в качестве фильтрующего материала используют ацетатцеллюлозную мембрану. Концентрат гельхроматографируют на колонке с сефадексом Гпри 5 оС в 0,1 М растворе хлористого натрия в дристствии 01%-ного хлористого кальция. Собирают первую белковую фракцию, которая со 1 ц держит 32% активности от всей взятой наразделение активности нейраминидазы куль туральной жидкости. Формула изобретения Способ выделения фермента нейрамини.дазы холерных вибрионов путем ионообменной щ сорбции и десорбции, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения выходапродукта. и сокращения времени, культуральную жидкость пропускают через карбоксильОый катионит в водородной форме при 15- 25 25 С, рН 5,1, колонку с катионитом промывают 0,1-0,2 М ацетатным буфером, рН 5,0с добавлением хлористого кальция, десорбируют фермент с колонки 0,1-0,2 М фосфат-.ным буфером, рН 6,0-6,5 при 5 оС в при сутствии стабилизатора 0,001-0,002%-ногоацетонитрила и из элюата гельхроматогра-,фией выделяют конечный продукт.Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:1. 1 Аъчеь Сйетп атос 1960, 82,4113.