Способ получения ауксотрофных мутантов холерных вибрионов

Изобретение относится к областймедицины, а именно микробиологии,Известен способ получения ауксотрофных мутантов холерных вибрионовпутем выращивания исходной культурыв питательной среде с последующейобработкой полученной культуры мутагеном, пассированием обратанной культуры на плотных питательных средах иотбором мутантов 1) .Однако известный способ сложен Ои имеет низкую частоту выделения мутантов при проведении генетическихисследований,Целью изобретения является повышение частоты выделения мутантов 15Эта цель достигается тем, что приосуществлении способа полученияауксотрофных мутантов холерныхвибрионов путем выращивания исходной культуры в питательной среде споследующей обработкой полученнойкультуры мутагеном, пассированиемобработанной культуры на плотныхпитательных средах и отбором мутантов, отличительной особенностью25является то, что исходную культурувыращиваютжидкой питательной .среде, в качестве мутагена используют умеренный холерный фаг и обработку проводят в полужидком агаре.Способ осуществляют следующим образом, Засевают петлю суточной агаровой культуры холерного вибрионав 5 мп бульона Мартена (рН 7,6-7,8),инкубируют при 37 С 4 ч. Затем0,3 мл молодой культуры переносят в З 5пробирку с 4 мл 0,7-ного агара,растопленного и остуженного до 45и высевают двухслойным методом наповерхности 1,5 агара Мартена вчашке Петри, После застывания верхнего слоя на газон культуры наносят2 капли умеренного холерного фагав виде "дорожки". Посев ставят в термостат на сутки при температуре выращивания 37 С . На следующий деньвырезают участки вторичного ростапо дорожке фагового лизиса и помещают в пробирку с 5 мл физиологическогораствора. Центрифугируют содержимоепробирки 20 мин при 3000 Об/мин. Насадочную жидкость удаляют, затем добавляют к осадку Физиологическийраствор до пеовоначального объемаи пробирку помещают в термастат доследукщвго дня. Через сутки содержимое пробирки центрифугирущт при техже условиях, удаляют надосадочнуюжидкость, добавляют физиологическийраствор. Пелученную суспенэию титруют до 10и высевают иэ разведений10 , 10 , 10 по 0,1 мп на агаровые пластинки, чтобы получить ростизолированных колоний (основной посев,исходная чашка). Выращивают 1824 ч при 37 С.Выросшие колонии методом реплик переносят на минимальную среду. После 48 ч инкубации при 37 С с исходной чашки петлей отбирают колонии, не выросшие на минимальном агаре,и готовят взвесь в 1 мл физиологического раствора.По 1 капле взвеси наносят на минимальный агар, агар Мартена и среды, содержащие ростовые добавки. Устанавливают зависимость от тех или иных факторов роста по общепринятой схеме Холлидея, Минимальную сре; ду готовят на забуферном агаре с добавлением сульфата аммония (О, 5 мл 20-ного раствора на 100 мл), глю козы 10,5 мл 40-ного раствора на 100 мл). Аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания добавляют после предварительной стерилизации в концентрации 100,мкг/мл сре - ды, витамины после дробной стерилизации в концентрации от 0,001 доО,1 мкг/мл. Изученные колонии ауксотрофов пересевают с основного посева в столбик 0,3 агара и сохраняют прикомнатной температуре.П р и м е р. Засевают петлю суточ ной агаровой культуры штамма холерных вибрионов Эль Тор 75 в 5 мл буль она Мартена рН 7,6 - 7,8) и выращивают при 37 С 4 ч. Затем 0,3 мл молодой растущей культуры вносят в 4 мл 0,7-ного агара, растопленного и остуженного до 45 С, и высевают двухслойным методом на поверхность 1,5-ного агара Мартена. Через 20 мин на газон культуры наносят 2 капли умеренного холерного фага 8556 в виде "дорожки". Умеренный фаг 8556 получают из одноименного штамма холер ных вибрионов Эль Тор. Штамм - продуцент фага 8556 (инаба) хранится в стобике 0,3 агара Мартена под слоем ваэелинового масла. Фаг получают общеприятным методом. Умеренный Фаг образует мутные негативные колонии с прозрачным ободком, в диаметре 1-2 мм. Относится по П серологичемкому типу Фага. Титр фага, исполь зуемого в предлагаемом способе, может варьировать от п,10 - п.108 фагочастиц в 1 мл. После нанесения фага на газон культуры посев ставят в термостат на сутки при 37"С, На следующий день скальпелем вырезают участки лизиса с вторичным ростом Фагоустойчивости культуры и помещают в пробирку с 5 мл физиологического раствора. Содержимое пробирки центрифугируют в течение 20 мин при 3000 об/мин, надосадочную жидкость Удаляют, к осадку добавляют физиологический раствор до первоначального объема, и культуру помещают в термостат при 37 ОС, Через 24 ч выращивания пробирку со взвесью центрифугируют при тех же условиях, как описано выше, удаляют надосадочную жидкость, добавляйт физиологический раствор к осадку. Полученную микробную суспенэию титруют до 10 и высевают982345 СоставительРедактор П.Горькова Техред С.Легеза Корректор Л.Шеньо Заказ 4025/4 Тираж 522 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5филиал ППП "Патент", г.Ужгород, ул.Проектная,4 из разведений 10 , 10 , 10по0,1 мл на агаровые пластинки, чтобыполучить рост изолированных колоний(основной посев, исходная чашка).Выросшие колонии переносят на минимальную среду методом реплик. Отборауксотрофных мутантов, не выросшихна минимальной среде, ведут через2 суток наблюдения с основного посева. Петлей отбирают часть колониис исходной чашки в 1 мп физиологического раствора в пробирке. По 1капле взвеси наносят на минимапьныйагар, агар Мартена и среды, содержащие ростовые добавки, по общепринятой схеме Холлидея. Учитываютрезультат. Через 1-3 суток выращи-вания при 37 с отмечают рост на агаре Мартена и средах, содержащих те или иные дополнительные факторыроста. На минимальной среде ростауксотрофных мутантов отсутствует.Колонию ауксотрофного мутанта снимают петлей в,исходной чашки встолбик 0,3 агара и сохраняют прикомнатной температуре. Предложенный способ примененна 7 штаммах вибрионов Эль Тор: 75,10 6216, 3639, 5879, 1861-34, 757,8860, нелизогенных, с прототрофнымтипом питания. Установлено,что пред-ложенный способ прост по технике выполнения, легко осуществим, сокра 35 щение чиспа переносов ауксотрофовпозволяет повысить частоту выделения мутантов при проведении генетических исследований,