Вектор pps-5-neo для введения и экспрессии генов в культивируемых соматических клетках млекопитающих

СОЮЗ СОЕЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК Ц 11 С 12 И 15/79 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ГОСУДАРСТ 8 ЕННЫЙ КОМИТЕТПО И 306 РЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(71) Институт молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта и Институт биоорганиеской химии им. М.М.Ремякинд (72) Е.И.фролова, И.С.Павлова, М.Л.Маркелов, П.М,Чумакон и В.С.Прасолов (53) 575.224.7.577.2(088.81 (56) Ы 1111 алв П.А. еС а 1 Гхр. Мед, 1987, ч.6 Г; 7, р,2053-2060. (54) ВЕКТОР рРБ-МО ДЛЯ ВВГЛЕНИЯ И ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ В КУЛЬТИВИРУЕпЬ 1 Х СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТКАХ МЛЕКОПИТАК 111 ИХ (57) Изобретение относится к биотехнологии, а именно к генетической инженерии. Нелью изобретения является Изобретение относится к биотехнологии, а именно к генетической инженерии, представляет интерес для различного рода научных исследований, в частности для изучения разного рода факторов дифференцировки и эролиферации, а также для получения линий клеток - эродуцентон практически ценных белковЦель изобретения - конструирование вектора, позволяющего достигнуть высоких уровней экспрессии чужеродных генов в клетках млекопитающих, а также обеспечивающего простые и удобные способы введения генов в состав вектора.Вектор на,основе ретровирусного вектора рР 8-4-эео, обеспечивающий введение и экспрессию чужеродных генов в клетках млекоэитающих. Кроме ЯО 1622396 А 1 2 конструирондние вектора, эозволяющего достигнуть ньк:эких уровней экспрес.сии чужеродных генон н клетках млекопитдк- щих, а также обеспечивающего простые способы клонирования генов н состав вектора. Вектор РРБ-эео размером 106 т.п,о., емкостью до 7,0 т,п,о., имеет уникальные сдйты рестрикции Н 1 пдП 1, Ба 11, ВдЫП н ЕсоН 1 лля клонирования чужеродных гонон поЛ контроль нромоторд 1 итомездлонирусд (СЮ/) а клонирондние генон с собстнецшпч промотором осущестнляется по сдйту С 1 а 1. Вектор обесэечиндет устойчивость клеток млекопитдющих к генетицину и метдтрсксдту, д клеток Е,со- сф 11 - к кдндмицину и дмшэиллиэу,того, общим свойством всех прототипных векторов янляется отсутствиеФа полилинкерной облдсти. (РВ состав лектора рРБ-пео ннодят сильный конститутивный промотор питомегалонирусд и индктивдции олиного из двух сдйтов Ба 11 н эолилинкерной области нектора.Ретронируснмй ректор рРБ-пео хардктеризу .тся следую асими свойств вамй. Размер некторд околс 105 т,п.о., фатазой встраиваемой НК около 7 т,п.о. Ректор состоит из: линейной формн некторной элазилы рБР 64 у которой полилинкер заменен единичным сдйтом Есок 1 плазми 1 д содержит ген устойчивости к ампициллину, двух фрагментов пронирусэ лейкоза мьпдей Молони, включдюгшх левый и эравьп 1 1,ТЙ область, ответственную эд упаковкуполных транскриптов ретровируснойконструкции н вирусоподобные частицы,а также прилегающие к 1 ТК участки клеточной ДНК, двух участкон начала реп"ликации вируса БЧ 40, содержащих такжеранний промотор вируса; гена пео, определяющего устойчивость клеток млекопитающих к генетицину и Е,со 1 дк канамицину; сигнала для сплайсингаиэ ранней области вируса БЧ 40, генадигидрофолатредуктазы мьппи, обеспечивающего устойчивость к метатрексату,сильного конститутивного промоторацитомегалловируса; полинкера, содержащего уникальные сайты рестрикцииБа 11, Н 1 пйПТ, ВапНТ и ЕсоК 1, по которым производится встраивание чужеродных генов под контроль промоторацитомегалловируса. 20Конструирование ретронирусноговектора рРЯ-пео приницпиально состоит в следующем. В вектор рРБ-пеовводят сильный конститутивный промотор цитомегаллонируса с однонременной инактивацией одного иэ двух сайтов Ба 11 в полилинкерной области.Введение чужеродных генов в клетки млекопитающих с помощью векторарРБ-пео осуществляют в два этапа.1. ДНК, вектора рРБ-пео с встроенным н него геном внодят методомДНК-трансфекции в клетки, экспрессирующие структурные белки вируса лейкоза мьппей (клетки ( 2 или подобные).2. После селекции клеток, экспрессирующих ретронирусный конструкт, насреде с генетицином производят сборвирусоподобных частиц из среды культивирования клеток и заражают клетки, в которых предполагается проводить экспрессию чужеродного гена.Для поньппения уровня экспрессии генав клетках используется амплификациявирусного материала в клетке на среде с метатрексатом,Наработка ДНК вектора рРБ-песпроизводится в клетках Е.со 11.П р и м е р 1.Конструирование ретровирусного вектора рРБ-пео ДНК вектора50рРБ-пес подвергают неполному гидролизу Ба 1 Т так,чтобы расщепился только одиниз двух присутствующих в плазмидесайтон, липкие концы достраивают фрагментом Кленова ДИК-полимеразы 1 н5присутствии всех четырех дКТР, расщепляют Н 1 пд 111, дефосфорилируют фос 1фатазой из тимуса теленка, оищаютэлектрофорезом в легкоплавкой агарсзе и лигируют со специально обработанным промотором цитомегалловируса.Для получения промотора цитомегалловируса СИЧ) вначале проводят модификацию сайтон в плазМиде рВС 12 СИЧ,Плазмиду переводят н линейную формуи лигируют в присутствии синтетического линкера, содержащего сайт рестоиктазы Ба 11. Полученную плазмидуРВС 12 СМЧ-Яа 11 гидролиэуют Ба 11,обрабатывают фрагментом КленоваДНК-полимеразы 1 н присутствии четырех МТР, расщепляют Н 1 пй 111 и очищают . 600 п,н. фрагмент, содержащий промотор СИЧ, электрофореэом нлегкоплавкой агарозе, Фрагмент лигнруют н вектор рРЯ-пес, подготовленный следующим образом: ДНК обрабатывают Ба 1 Т при условии частичного гидролиза и фрагментом Кленовав присутствии четырех ЙИТР, затемН 1 пд 111 и фосфатазой. Лигиронаниупромотора СИЧ н вектор рРБ-пео дает искомый вектор рРЯ-пео,П р и м е р 2. Экспрессия гена-интерферона человека н клеткахРаг,С помощью вектора рРБ-пес дости"гают эффективной экспрессии гена-интерферона человека н клеткахКаг 1, составляющей 000 ед./мл всутки. Увеличение уровня экспрессиигенов, клониронанных н векторерРБ-пео, достигается за счет увеличения,дозы гена н клетках при ихкультивировании на среде с метатрексатом.Формула изобретенияВектор рРБ"5-пео для введения и экспрессии генов н культивируемых соматических клетках млекопитающих размером 10,6 т.п.о., содержащий плазмидную ДНК рРБ-пео-размером1 О т.п.о. и мол.м. 6,6 Ид, у которой крайний участок узнавания рестриктазы Ба 11 в полилинкере эатуплен, Бги 1-НдпйПТ - фрагмент плаэмидной ДНК рВС 12 СИЧ размером 0,6 т.п.о, и мол.м. 0,4 Мд с конститутивным промотором иитомегалонируса, у которого затуилен участок узнавания рестриктаэ Бги 1, генетические маркеры; пео - определяющий устойчивость клеток млекопитающих к генетниину (С 418), а клеток ЕзсЬег 1 сЬда со 11 к канамицину, )ГКТ - обеспечивааЧийСоставитель С.БаидуринТехред Л.Олийнык , Корректор С.иекмар Редактор Н.Яцола Заказ 88 Тирак ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Иосква, В"35, Раущская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат фПатент", г.уагород, ул. Гагарина, 101 5 1622 устойчивость к метятрексяту, Ар - обеспечивяющий устойчивость к ямпициллину; уникальные сяйты рястрикции Ндпй 111, ИаюН 1, Ба 11, ЕсоН 1,В яП 1, С 1 а 1, йой 1, емкость вектора -вф 5 до 7 т.п.о., встраивание чужеродных генов под контроль промоторя цито 396 6миаловируся по сайтям Нпд 111, Яа 11,ВавН 1 и ЕсоН 1, а чужеродных геновс собственным промотором по сайтуС 1 а 1, спектр хояяев; Фиброблясты мыши (Н 1 НЗТЗ, Иа 1 Ь/с), Аиброблястыкрысы (Най 1 и Най 2), клетки обезьяны - Сов 1.