Вектор pps-4-neo для введения и экспрессии генов в культивируемых соматических клетках млекопитающих

СООЭ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХЩСПУБЛИН щ) С 12 Н 15/00 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ 1(71) Институт молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта и Институт биоорганической химии им.М.М.Р 1 емякина (72) Е.И.Фролова, И.С,Павлова, М.Л.Маркелов, П.М,Чумаков и В.С.Прасолов(1987), ч.6, У 7,рр. 2053-2060.,(54) ВЕКТОР рРБ-ТО ДЛЯ ВВЕДЕНИЯ ИЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ В КУЛЬТИВИРУЕМЬЗХСОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТКАХ МЛЕКОПИТАНМЧИХ(57) Изобретение относится к биотехнологии, а именно к генетической инИзобретение относится к биотехнологии, а именно к генетическсй инженерии, представляет интерес для различного рода научных исследований, в частности для изучения разного рода факторов дидференцировки и пролиЬерации, а также для получения линий клеток - продупентов практически ценных белков.Цель изобретения - конструирование вектора, позволяющего достигнуть высоких уровней экспрессии чужеродных генов в клетках млекопитающих, а также обеспечивающего простые и удобные способы клонирования генов в состав вектора.В вектор рРБ-пео, содержащий синтетический полилинкер, вводят ген ЭНДОВ, находящийся под контролем раннего премотора вируса Р 40. ЯО 1622395 Д 1 2женерии. Целью изобретения является конструирование вектора, позволяющего достигнуть высоких уровней экспрессии чужеродных генов в клетках млекопитающих, а также обеспечивающего простые способы клонирования генов в состав вектора, Вектор рРБ-пео размером 1 О т.п.о. и емкостью до 7 т.п.о. имеет уникальные сайты рестрикции Ба 11, Н 1 пд 111, ВашН 1 и ЕсоВ 1 для клонирования чужеродных генов под контроль промотора ретровируса, а клонирование генов с собственным промотором осуществляется по сайту рестрикции С 1 а 1. Вектор обеспечивает устойчивость клеток млекопитающих к генетицину и метатрексату, а клеток Е.со - к канамицину и ампициллину. Ретровирусный вектор рРБ-пео характеризуется следующими свойстнами. Размер вектора около 10 т,п.о., емкость встраиваемой ДНК - до 7 т.п.о.Вектор состоит из; линейной Аормы векторной плазмиды рЯР 64, у которой полилинкер заменен единичным сайтом Есой, плазмида содержит ген устойчивости к ампи 1 рллину, двух фрагментов провируса лейкоза мышей Молони, включающих и правый 1.ТР, область (, ответственную за упаковку полных транскриптов ретровирусной конструкции в вирусоподобные частицы, а также прилегающие к ,ТВ участки клеточной ДНК, полилинкера, содержащего сайты рестрикции (Яа 1, Нгпд 111, Ва 11, ВашН, Есой 1), по которьгм пре полагается клонирование чужеродьченогв, двух участков на 1 Ь 2239530 чала репликации вируса БЧ 40, содержащих также ранний промотор вируса, гена пео, определяющего устойчивость клеток млекопитающих к гене 5 тицину и Е.со 11 - к канамицину, сигнал для сплайсинга из ранней области вируса БЧ 40, ген дигидроФолатредуктазы,мьппи, обеспечивающего устойчивость к метатрексату, уникальные 10 сайты рестрикции Нпд 1 И, ВашН 1, ЕсоК 1, Ко 1, С 1 а 1, встраивание чужеродных генов под контроль промотора ретровируса производится по сайтам Ба 11, Н 1 пд 111, ВашН 1, ЕсоК 1, 5 встраивание чужеродных генов, находящихся под контролем собственных промоторов, производится по сайту С 1 а 1, левее гена пео.В ДНК вектора рРБ-пео вводят 20 специально сконструированный блок, состоящий из гена РНРК, находящегося под контролем раннего промотора БЧ 40. Конструкция блока состоит в следующем. Ген РНРК встраивают в 25 плазмиду рБЧВрй вместо гена ГрС, сайт Рчи 11 слева от промотора заменяют на сайт ЕсоК 1, а сайт Ндпд 111 справа от промотора - на сайт Мо 11. Зачтем готовый блок встраивают в вектор рРБ-З-пео.Введение чужеродньм генов в клетки млекопитающих с помощью вектора рХБ-пес осуществляется в два этапа.1. ЛНК вектора рРБ-пео с встроенным в него геном вводят методом ДНК-трансфекции в клетки, экспрессирующие структурные белки вируса лейкоза мьппей (клетки ( 2 или подобные).2. После селекции клеток, экспрессирующих ретровирусный конструкт, на среде с генетицином ( Ц 418) производят сбор вирусоподобных частиц иэ среды культивирования клеток и заряжают клетки, в которых предпола гается проводить экспрессию чужеродного гена. Для повышения уровня экспрессии гена в клетках используется амплификация вирусного материала в клетке на среде с метатрексатом,Наработка ДНК вектора рРБ-пеопроизводится в клетках Е.со 1.П р и м е р 1. Конструирование вектора рРБ-пео.А. Получение блока, содержащего ген ПНРК мыши,под контролем раннего промотора БЧ 40.Клонирование гена РНГК в плазмиде рБСКр. Плазмиду рБЧрр расщопляют ЕсоК 1 и Ньпд 111, меньший Фрагмент, содержащий промотор БЧ 40, ген устойчивости к ампициллину и огдрВК 322 выделяют электроФорезом в легкоплавкой агарозе (1 ЛРА) нлигируют с большим Фрагментом плазмиды ИИТ ЧВНРР, расщепленной ЕсоК 1 и НпдП 1, обработанной фосфатазой и очищенной электрофорезом в 1,ИРА. Е результатеполучают плазмиду р 1, содержащую ген РНРК под контролем раннего промотора БЧ 40Получение плазмиды р 2. Нлазмиду р 1 расщепляют Рщ 11, дефосфорилируют с помощью фосфатазы из тимуса теленка (С 1 Р), очищают электроФорезом в 1.ИРА и лигируют синтетическим 8-членным ЕсоК 1 линкером. В результате получают плазмиду рЗ, содержащую слева от промотора БЧ 40 сайт ЕсоК 1.Получение плазмиды рЗ. Плазмиду р 2 расщепляют Нпд 111, обрабатывают С 1 Р, очищают электрофорезом в 1 ЛРА и лигируют с синтетическим Яо 11 лин-. кером. В результате получают плазмиду рЗ, содержащую справа от промотора БЧ 40 сайт Иой 1.Б, Получение вектора рРЯ 4.Удаление двух ГсоК 1 сайтов на концах сегмента рБР 64 вектора рРР-пео; плазмиду рРБ-пео переводят в линейную форму частичным гидролизом ЕсоК 1, обрабатывают Фрагментом Кленова ЛНК- полимеразы 1 в присутствии четырех РКТР и лигируют. Полученную плазмиду рРБ,5-пео, содержащую два ЕсоК 1 сайта - в полилннкере и слева от 1.ТК переводят в линейную Форму частичным гидролизом ЕсоК 1, обрабатывают Фрагментом Кленова ДНК-полимеразы 1 в присутствии четырех дХТК и лигируют Полученная плазмида рРБ-пео содержит уникальный ЕсоК 1 сайт, расположенный в области синтетического полилинкера.Удаление ВащН 1 сайты справа от гена пео в плазмиде рРБ-пео. Плаз миду рРБ-пео переводят в линейную форму частичным гидролизом ВашН 1, обрабатывают фрагментом Кленова ДНК-полимеразы 1 в присутствии четырех дИТР и лигируют. Полученная плазмида рРБ-пео содержит уникальный ВашН 1 сайт в области синтетического полилинкера.Клонирование блока ранний промотор БЧ 40 - ген РНРК в плазмипе рРБ-пео. Илазмиду р 3 расщепляют1622395 6 Формула изобретения Вектор рРБ-пео для введения и экспрессии генов и культивируемых соматических клетках млекопитающих размерон 10 т.п.о, и мол.м. 6,6 М и содержащий плаэмидцую ЛНК рРБ-пео размером 9,6 т.п.о. и мол.м. 6,34 Мд, в которой удалены оба участка уэиавання рестрикционной эндонуклеаэы ЕсоЕ 1 н составе Есой 1 - ЕсоВ 1 Фраг 40 Составитель С,БандуринТехред Л,Олийнык Корректор М,Демчик Редактор Н.Яцола Заказ 88 Тирам ПодписноеВНИКЛИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раущская наб д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина,101 Есой 1 и Вп 111, выделяют менмпий1,6 т.п.н, Фрагмент электрофорезом в 1.МРА и клонируют его в плдэмиде рРБЗ, расщепленной ЕсоВ 1 иВВ 111 и очищенной электрофореэом н1.МРА, В результате получают плдэмиду р 4.Получение вектора рРБ-пео, Плаэмиду р 4 расщепляют ВВ 111, достраивают липкие концы Фрагментом Кленова ЛНК-полимердэы 1 в присутствиичетырех ЛИТР, обрабатывают Н 1 пд 111,выделяют меньший фрагмент 1,6 т.п.н,электрофореэом н 1,МРА и клоццруютего в плаэмиде рРБ-З-пео, обработанной последовательно ЕсоК 1 ФрагмецтонКленова ДНК-полцмердэы 1 н присутствии четырех ЖТР, Н 1.пд 111 и С 1 Р иочищенной электрофореэом в 1,МРА, Полученная плаэмидд является искомымвектором рРБ-пео.П р и м е р 2, Зкспрессця гена-интерферона челонекл н клетклхКай 1,С помощью вектора рРБ-пео достигают эффектинную экспрессию гецл-интерферона человека н клетках Рас 1,составляющая 500 ед./мл н сутки. Увеличение уровня экспрессии генов, клонированных и векторе рРБ-пео, достигается эд счет увелиения дозы гена в клетках при их культивировании на среде с метдтрексатом. 5 10 15 20 25 30 35 мента плаэмиды рБР 64 и удалец участок узнавания рлгтрикциоццой эндо- нуклеаэы ВдщН 1, находящийся нл расстоянии 0,3 т.п.о. от участка узнанация для рдстрикционной эндонуклеаэы С 1 а 1 в составе ретровирусной части рРБ-пео, Нпд 111 - Ртщ 11 " фрагмент плдэмидцой /НК рБЧВрй размером 0,4 т,п.о. и мол.м, 0,26 МЛ с участком начала репликдции (Ог) с промотором ранней области вируса БЧ 40, в котором участок узнавания для растриктаэы Рчи 11 заменен на участок узнавания для рестриктазы ЕсоК 1, д участок уэцанлнцл для рестриктазы Нпд 111 заменен на участок узнавания для рестриктдэы НоС 1, Н 1 п 4111 - ВВ 111 - Фрагмент плдзмидной ЛНК рММТЧОНРН рдэмером 1, 2 т.п.о. и мол.м. 0,79 Мд с геном дигидрофолатредуктаэы (ВНРН), н котором участок узнавания для рестриктдэы Н 1 пд 111 заменен цл Нос 1 и удален участок узнавания для рестрцктаэы Ве 111 с помощью достраивания Фрагментом Кленова ЛНК полимердэы 1: генетические млркеры; пео - определяющий устойчивость клеток млекопитаюших к гецетиццну (0418) и ЕэсЬет 1- сЬа со 11 - к клцдмццццу, 1 РНТ обеспечивающий устойчивость к метатрексату, Лр - обеспечивающий устойчиность к дмпициллицу, уникальные сдйты рестрикции; Н 1 пс 111, ВавН 1, Есой 1, Вр,1 1, С 1 а 1, Кос 1, емкость вектора - до 7 т,п,о. встраивание чужеродных генон под контроль промоторд ретронирусл по сайтлм Ба 11, Н 1 пд 111, ВлщН 1 и ЕсоР 1, д встраивание чужеродных генов с собственным промоторомпо сайту С 1 д 1, спектр хоэявн - клетки млекопитающих, например Фибробласты мьпди (Н 1 НЗТЗ, Ва 1 Ь/с) Фибробласты крысы (На 1 и Най 2), клетки обезьяны - Соэ 1.