Способ получения эндонуклеазы рестрикции н а i

ОЮЗ СОВЕТСНИХ ЦИАЛИСТИЧЕСКИ ПУБЛИК(191 11 1)5 С 12 Н 9/22 (С Н 9/22,ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ 21) 4 22) О 46) 4 71816/30-136.06,885. 12.90, Бюл.а "чно-исследовогас ко-тех ол огол огич ес ки а ктотносится к био ии в частности ентов из пкроб к особям полу р рикпии 1 Па и и биотехнол ых изводству фер ток, а именно кле сп ст ндонукл еа зы ссы Наепор 11б ть исполь ния бнои ця 1 аешо 1 уп 1 сц овано в генной мо: левого продиСпособ ос разом,Ьиомассу (ВКПИ В"407 ультразвука генату доба в. ют следующим чцес 11 ця аепо 1 ус 1 сця шают с помощью к кчеочному Гомоентрированну,д Наепор и) ра эруза гем яют ко сОСУДАРСТЭЕННЫЙ КОМИТЕТО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМРИ ГКНТ СССР Изобретение относится к технической биохииии и биотехнологии, в част ности к производству ферментов иэ микробных клеток, и может быть испольовано для различных молекулярно биологических и генноинженерных ра - бот.11 елью изобретения явчястся упроще н е процесса и иовышения качества цекта,женерии, С целью упрощения процессаи повьппения качества целевого фермента исхдную биомассу На 1 пор 111 ця Ьаепо 1 уг 1 сця В 11 И Вразрупают ультразнуком, Полученный клеточный гомогенат фракцион(руют в двухфазнойсистеме, содержащей 72-ный полиэтиленгликоль и 22-ньй декстран в присутствии 38-45 МИ ИаС 1 при рН 7,6, верхнюю нолиэтиленгликолевую фа зу, содержащуи целевой фермент, наносят наколонку с фосфоцеллюлозой Р 1, а элкцию белков проводят линейным градиентом концентрации ИаС 1 от 0,2 до1,О И в буфере. Выход рестриктаэыН 1 а 1 составляет 4-6 тысед . акт/гбиомассы с концентрацией 25 тыс. ед .акт/мл. В готовом продукте примесейнуклеаз не обнаруживается при обработке ЛИК 15-кратным избьггком фермента в течение 20 ч. с иес ь и оп и этил е нгли коля и де кс тра на в калийфосфатном буфере рН 7,6, до конечной концентрации в смеси полиэтиленгликоля 7,ОХ, декстрана 2,0 Е иНаС 1 до концентрации 38 - 45 МИ. После тщательного перемешивания смесь центрифугируют при 5 - 10000 д в течение 10 - 20 мин, верхнюю полиэтиленгликолевую фазу, содержащую целевой продукт, собирают, разбавляют буферои и наносят на колонку с фосфоцеллюлозои Р 11. Проводят элюцию. белков линейныи градиентои концентрации ИаС 1 от 0,2 до 1,0 11 в буфере. Фракции, содержащие эндонуклеазу Н 11 а Е, собирают и концентрируют диализомпротив 50 Х-ного раствора глицерина в буфере. Выход фермента из 10 г клеток 40 - 60 тыс.ед.акт. Хранится прео пдрат при температуре минус (20+2) С5 в течение 12 мес без снижения активности. Свободен от значительных примесей неспецифических нуклеаз: обра - ботка ДНК Фагане менее чем 15- кратным избыткои Фермента в течение дгительного времени (17 - 20 ч) при 37 С ле изменяет специфической картины гидролиза,П р и м е р 1. Все операции поочистке Фермента проводят при (44) С.5Акти,п;сть рестриктазы Над Т тестируют методом гидролизд ЛНК фагавтипичных условиях с последующимрдэделениеи полученных фрагментовэлектрофорезои в 1,8 Е-ной агарозе.Зд единицу активности принимают минимдльное количество Фермента, необходимое для полного специфического гидрочиза 1 мкг ДНК фага 7 в течение1 ч при (37+1) С.2510 г замороженной биомассы Ндетор 1 д 1 ц з Ьаешо 1 у сц в ВКПМ Всуслендируют в 20 мл 10 мМ калийфосфатного буфера рН 7,6, содержащего 7 мМ2-меркдптоэтанол, О, 1 мМ ЭДТА (буфер Л), добдвляют тритон Хдо конечной концентрации 0,1 Х и обрабатывают ультразвуком при 20 кГц и амплитуде (17+2) мкм в течение 45 с10 рдз с интервалом 45 с для охлажде 35ния смеси, К клеточному гомогенатупри постоянном перемешивании на магнитной мешалке приливают 30 мл смеси,содержащей 212 полиэтиленгликоля и6 Х декстран, 3,45 мл 1 м раствора 40ИаС 1 (до конечной концентрации 38 мМ)и 26,55 мл деионизованной воды, Смесьпродолжают перемешивать в течение15 мин, затем центрифугируют при5000 об/иин в течение 20 мин. Верхнюю Фазу отбирают, разбавляют в 2,5раза буфером А и наносят на колонкус Фосфоцеллюлозой Р 11 (1,5 к 30) см,уравновешенную буфером А. Колонкупромывают 50 мл 0,2 М ИаС 1 в буфере50А, Фермент элюируют линейным градиентом концентрации ИаС 1 от 0,2 до1,0 М в буфере А. Общий объем градиента 200 ил. Скорость нанесения наколонку, промывки и элюции 20 мл/ч.Собирают фракции по 5 ил и анализируют на активность рестриктазы НЬа 1,отбирают аликвоты для испытанияобъемом 5 мкл, Фракции, содержащие целевой продукт, которые элюируются в дидлд зоне концентраций ГдС 1 0,52 0,62 М, объсдил: ют ( = 25 мл), перенг елт в лидии ныл мс шок и диализуют против 300 - 350 мл 503-ного растворд глицерина в буфере А. Время диа - лиза 14 - 17 ч. Выход Фермента с операции 60000 едакт, Концентрация фериента 15 тыс.ед.акт,/ил. Полученный препарат эндонуклеаэы рестрикции НЬа 1 хранят при (-20) С в течение 12 мес без снижения активности, Содержание примесей неспецифических нуклеаз н препарате оценивают двумя методами: обработкой ДНК Фагаизбьггкдми Фермента в течение длительного вреиени и мегодом рестрикция-лигировдние-повторная рестрикция. Установлено, что при обработке 1 мкг ДНК Фага15 ед.дкт, препарата рестриктазы 1 йа 1 (15-крдтным избьггком) в течение 20 ч при 37 С не изменяется четкая специфическая картина гидро- лиза. Фрагменты, получаемые при обработке 1 мкг ДНК фага 3 ед .акт. препарата 1 Ьа 1 в течение 17 ч прио37 С, линируются ДНК-лигазой Т 4 не менее чеи на 90 Е и полностью специшически гидролизуются при обработке препаратом Ьа 1,П р и м е р 2. Эцпонуклеазу рестрикции НЬа 1 выделяют из 10 г клеток аналогично примеру 1 за исключением того, что к клеточному гомогенату приливают 4,5 мл 0,9 М ИаС 1 (до конечной концентрации 45 иМ) и 25,5 мл деионизовднной воды, Выход препарата Фериента из 10 г 48 тыс. ед.акт.Четкая специфическая картина гидролиза наблюдается при обработке 1 икг ДНК фага15 ед.акт. препарата в течение 17 ч при 37 ОС.Фрагменты, полученные лри обработке 1 мкг ДНК Фага 6 ед .акт. препарата в течение 17 ч при 37 С лигируюто ся ДНК-лигазой Т 4 на 902 и полностью специфически гидролизуются лри обработке препаратом рестриктаэы НЬа 1. П р и и е р 3. Эндонуклеазу рестрикции НЬа 1 выцеляют из 10 г клеток аналогично примеру 1 за исключением того, что к клеточному гомогенату приливают 4,5 ил 1 М ИаС 1 (до конечной концентрации 50 мМ) и 25,5 мл деионизованной воды. Выход препарата фермента из 10 г клеток 48 тыс.ед,акт. с концентрацией 9,5 тыс,ед.акт./ил.Сос та вит ель В. Варламов Редактор О. Спеси вых Техр ед М. Дидык Корректор И.Эрдейи, Заказ 3867 Тираж 478 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,10 5 16При обработке 1 мкг ДНК фага ф 10 - 13 ед .акт. препарата в течение 17 ч при 37 С четкой картины рестрикции не наблюдается, полосы фрагментов размыты, что указывает на наличие заметных примесей эндонуклеаэ.П р и м е р 4 . Эндонуклеазу рестрикции НЬавыделяют из, 10 г клеток аналогично примеру 1 эа исключением того, что к клеточному гомогенату приливают 3,5 мп 0,9 И НаС 1 (до конечной концентрации 35 мИ) и 26,5 мп деиониэованной воды. Выход препарата фермента из 10 г клеток 30 тыс, ед . а кт . с концентрацией 8000 ед/мл. Примеси неспецифических эндонуклеаэ, экэонукпеаэ и фосфатаз в препарате не обнаруживаются. 13490 6Формула из обретенияСпособ получения энпонуклеаэы рестрикции НЬа 1, предусматривающийразрушение биомассы продуцента НаешорЬ 1 ив Ьаешо 1 УСсцв ультразвуком,фракционирование полученного клеточного гомогената, хроматографию нафосфоцеллюпозе Р 11 и диализ, о тличающийся тем, что, с целью упрощения процесса и повышениякачества целевого фермента, в качестве продуцента используют штаммНаещорЬ 1 ов Ьаешо 1 уй 1 сцв ВКПМ В 4070, фракционирование клеточногогомогената проводят при рН 7,6. двухфазной системе, содержащей 7-ныйполиэтиленгликоль и 2 Х-ный декстранв присутствии 38 - 45 мИ ХаС 1.