Способ определения концентрации днк

(19) 01) 11 С 1 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН ВТОРСКОМУСВИД СТВ ПРЕП гидр тем,7) СПОСОБДНК путем 3 ения времени ан аскевич хлор но-ис следицинской ествляютй трал из ую т ради ют в среде с ЬаЬ 1 цв К,( ) 63.32.02(088,8(56) 1, Спирин А.С. Спекческое определение суммарчества нуклеиновыхкисломия", 1958, т, 23, вып.2, НоЛ"Логяепвеп Е.Еса 1 Аввау оХ РеохугдЪоапй РеохугдЬопис 1 ехс Ас 1ВгосЬеш, Л.", 1952, чо 1.р, 400-403 (прототип),рофотного с. М 1 сг ис 1 ео(54) ( РАЦИИ чаю сокра ДНК о затем кубир асдйо ЛЕНИЯ КОНЦЕНТлиза, о тл ичто, с цельюлиза, гидролиз ой кислотой, ролизат и ингоЬас 11 цвИзобретее 111 енуклеиновых кислот и );:а;-,.:,-:,.гпальз ОВЯ е 10 при; е-;ве цс -,-:,Ции ДНК В Бадцых ряст-,огических тканях,ЪИзвестДн способ Гп:а;:.центрдцик Е 1 ПК пас-лизааСущность метсда состав.ном гидролизе ДНК в 0,5 ц, 1 С)1,.течение 25 мке 1 г,ве 1 100щим определением кое 1 цее 1 тря 1 Ег 1 г, " .10формуле, после определекл зцдч,ПЕ.цоптической плотности раствора .",.:Кпри 270 и 290 ю 1 к ".13Однако с помощью даццага методанельзя определить концентряцк:о,".Кменьше чем 5 мкг/мп к кроме то:.аМЕТОД НЕДОСтатачца СГЕЦКфЕ 1 ЕЦ,. Еаккак определению коццецгра -11 и.ПК;. ешают примеси РНК,. белка,. Палпсдхд.;.:11 дов ,Наиболее бле 1 зкея к изобрете:.Попо технической сущности к досткгдемо"му результату является м 11 крабе 1 олагк -ческий способ определения концентрации ДНК.СпОсОб Осцавде 1 ня прег 1 вяри тельном фермента".Ивца 1 ге:.д 1)алка .ПП (с помощью ДНК-аз п тецецк: 16п37 о С с послегУнщей ИЕ,:кубдгке 1ролизата ДНК в питательной ар=де. г1.ассоЬасе.1 еез ЯС 1 С 1 ор 11=).цз .".-237С. Концентрацию ДН(;)ер. ддг, ькалибровочному Графику завесе.:;.Ос)1;оптической плотности ку;,ьтуьбов прк 650 ммк ат каццецтгяьеоксиркбонуклеазцдав в сае; в . , -,г;,дезоксиркбонуклеозкдов соотде 327 г ДНК,. Зткм способа:ЗэГ.-,делить концецтрацкЕо 1 ПК 1:0,3 мкг,/мп Г 2,Недостатками известков:являются ега трудоемкость 11 длность (время анализа здцк:.-",-.нее /еО ч). Кроме Гога фер:н:ц Г - .ный гидролиз це позволяе пал.:.сизвлечь 11 нк кз тканей к требуегчия дефицитных ферментятквцых ив ;яц;ратов (ДНК-азы),Цель нзобрете 1 гпя - сак)Яшееце в-,.мени анализа.Поставленная цель достиг;етсьтем чта согласно способу Оцрддз Оцк".концентрации ДНК путем гкдролкз,:)гидролиз ДНК осуществля 1 от хлорнойкислОтОЙ, зятРМ нейтрд:1 кзу:от Г:.1,1 ра)".зат и кнкубиру 1 от в сране с . Яс.:ОЬЯ.1 еез ЯСЫор 111 еез Н,НО ш з 1 ЕКЕраарГаНИЗ- цее " г 1 е 1"я"езецой среде проктгв кд 1)011:;Езд ДНК является необ 1)г.мы. к специфическим фактором ростаКае Еец рапид ДНК определяется по калибра дачному графе 1 ку, построеннопля зависимости Оптической плате 10 сте. к"льтуоы МР 1 кроарГяцизмав при650 ммк от концентрации продуктов гид.полцзд 111)( в проае.Спо аб осуЕНествляют сл ду 1 ощим обвазам,Неабхоцкмые реактивы; высокомолекулярная 1 НК, вьеделее 1 ная из зобиойжелезы теленка и диализовянная в те.Нке, ст протиь 11,0, 1 н. НС 10 Е,02 ц, ПС 1 ОН 0,5 ц. НС 101, растворцасьшЕеццого КОН, культура 1 ЯССОЬЯС 1.11 .з дсо 1 ор 11,пз Но, питательнаясреда дге 1 микроорганизмов,5 мл раствора ДНК смешивают с 5 млраствора 1 ц, НС 10. и кипятят на водяной бяце в течение 25 мкн. Г 1 олучен 1.-11 гкдролкзят ДНК охлаждают и нейтрд)1 изу 1 о 1 цескольке 1 ми каплями раствора КОП. Выпавший осадок отделяютпецтрифугкрава 11 ием (3000 аб/мин,20 мкц), Р надосадачной жкдкости остд 1 отся продукты кислотцагс гкдролизаДПК, Ка Ецецтрдц:"Ею ДПК в надосадачной.е:.кпкосте 1 определяют спектрофотометричеси, П а; в .Исывдемом экспериментеконцентрация ДНК в растворе составляет 45 мк; /.1 л (стяцдярте 1 ььй раствор).Ст,:Плср- цый раствор разводят дистил;1.Овя:1 Й БОдай для получения ряствэ:Ов 1 К и дкдпязоце концентрации.дол.": ке ка Ецецтрдции ДПК осущесТпч;ют .1 извесНаму спосаау,псаб. . "1 дсеяцные ме 1 ке)оае)Гянкзмаг пк гб)кэу 1 от в термостате прк1 еееИе 1 б ч. ОптЕГЕескуюи:п)ТПЕаст: культур микроорганизмов :ЛЕ)алел:.от цд спектрсфатаметре при .5 )1;,к пя каждого развеения ДНК с";.вят две параллельные пробы. В качеств паобы, против которой прокзнал;".т е 1 змее)ее 1 е 1 е с.1 ужкт раствор, .е11 О,э ме Н 0 . 0,3 мл питаелца .).ЕыНя Ос 10)де 1 ии палучее 1 е 1 ь 1 х дЯннь 1 х .троя. к;либровачную кривун зависи.)Остк Езе Екчкцы Оптической плОтнОсти куг:ьтуре микробов ат концентрации ДНК в растворе.1112062 туры микробов от концентрации ДНК врастворах. Содержание ДНК в гробе, мкг/мл Оптическая плотность при 650 ммк Проба 0,25 0,03 0,50 1,00 1,70 2,55 3,40 5, 10 6,80 10, 00 водят в 10 раз. Установлено, что оптическая плотность культуры микробов 30 равна 0,65, 0,66, 0,64 (3 параллельные пробы) и в среднем составляет 0,65 оптических единиц. По калибровочной кривой 0,65 оптических единиц соответствуют 6,75 мкг ДНК в 1 мл, Общий объем гидролизата равен 2,5 мл.Следовательно, в 1 лейкоците содержится следующее количество ДНК:(б, 75 мкг ДНК/мл2, 5 мл 10):29,5 10 = 5,72 10 мкг ДНК или 5,72 10 г ДНК,что соответствует данным литературы о содержании ДНК в клетках млекопитающих.Нижняя граница чувствительности предлагаемого способа определения ДНК составляет 0,25 мкг/мл. Таким образом, предлагаемый способ определения концентрации ДНК позьоляет сократить время анализа в 2,5 раза и не требует дефицитных реактивов. ВНИИПИ Заказ 6420/ 19 Тираж 521 Подписное Филиал ППП фЪатаатфф,г. Уззород,ул.Проектная, 4 В таблице приведена зависимостьвеличины оптической плотности кульП р и м е р . Определение концентрации ДНК в лейкоцитах крови.Лейкоциты из гепаринизированной крови выделяют общеизвестным методом с использованиемжелатины. Клетки промывают холодным физраствором и подсчитывают их количество в камере Горяева. Затем клетки гомогенизируют и дважды промывают в холодной0,2 н. НС 10 для полного удаления кислоторастворимых метаболитов ДНК (дезоксирибонуклеозиды и дезоксирибонуклеотиды), Полученный после отмывок осадок гидролизуют в 2,5 мл 0,5 н. НС 10 в течение 25 мин при100 ц С.) Гидролизат нейтрализуют двумя-тремя каплями раствора КОН и проводят микробиологическое определение ДНК. После определения оптической плотности культуры микроорганизмов определяют концентрацию ДНК в пробе по калибровочной кривой,При подсчете лейкоцитов установлено, что их количество составляет629,5 10 клеток, Для микробиологичес" кого определения ДНК гидролизат разО, 045 0,085 О, 190 0,230 0,340 0,530 О, 650 0,950 0,025 0,050 О, 100 0,210 0,290 0,310 0,540 0,650 1,100