Способ получения гидрогеназы

сульфатом аммония без предварительной термообработки, очистку гидрогеназы проводят хроматографией наАенилсеАарозе СЬВ, повторяя этуоперацию дважды. Отделенный ацетоновый экстракт упаривяют и после омыления липиднсй Аракции из него выделяютубихинон ОВ и меняхинон МО,Предварительная обработка клетокбактерий охлажденным ацетоном позволяет извлечь каротиноиды, хлороАиллы,липиды, хиноны и другие липоАильныесоединения, частично разрушить структуру мембран, повьппает солюбилизяциюбелков, способствуя, тем самым, повышению выхода фермента.При предварительной термообряботке бесклеточного экстракта происходит денатурация термолабильныхбелков, которые, выпадая в осадок,соосаждают частично гидрогеназу, чтоуменьшает выход Аермента, Если термообработку проводить после Фракционирования сульфатом аммония, то устраняются сорбционные потери гидрогеназы и при предварительном фракционировании (ИН) 504 устраняется частьбелка, не обладающая ферментятивнойактивностью, что способствует болееполному выделению гидрогенязы.П р и м е р 1. Клетки ТЬ.осарвагозеорегс.з.па штамм ВВБ выращиваютпо известной методике в янаэробныхусловиях.150 г сырых клеток суспендируютв 150 мл 0,02 И кальцийфосАатном буФере (рН 7,0) с помощью магнитноймешалки в течение 1 ч. К полученнойсуспензии добавляют 1,5 л охлажденного ацетона, перемешивают, Клетки отфильтровывают в воронке Бухнеря подвакуумом и промывают 1 л охлажденногоацетона, Экстракты объединяют дляполучения убихинона Яя и менахиноня%юКлетки после обработки ацетономвысушивают под вакуумом и суспендируют в дистиллированной воде в соотношении 1:20, суспензию обрабатываютультразвуком ня дезинтеграторе втечение 30 мин при 22 кГц. Растворимую фракцию, содержащую гидрогеназу,отделяют центрифугированием в течение 30 мин при 5000 е.К супернатанту добавляют до 30%нясьпцения сульАят аммония и выпавшие в осадок примесные белки и мембранные Фракции клеток отделяют40при 40-45 С. К сухому остатку прйливают смесь, состоящую из 200 мл96%-ного этанола, 130 мл дистиллированной воды, 12,б г КОН и б гпирогаллоля, нагревают до кипенияи проводят омыление в течение 25 минв токе аргона, Смесь охлаждают набане со льдом и проводят экстракциюхинонов из неомыленной фракции гексаном (Зх 100 мл). Гексан упаривают нароторном испарителе. Сухой краснокоричневый осадок растворяют в 3 млсмеси для элюции и хроматографируютна колонке с окисью алюминия, Элюцию проводят смесью петролейныйэфир (т.кип,40-70 С) - хлороформ - 55диэтиловый эфир в отношении 85:10:Ь.Фракцию в виде ярко-желтой полосыс 1 = О,7, содержащую менахинон, ифракцию в виде ярка-оранжевой по 5 10 15 20 25 цент рифугировянием в течение 60 мин при 5000 д. Для осаждения гидрогенязы концентрациюсульфята аммония увеличивают до 70% и суспензию центриФугируют в течение 15 мин при 5000 я. Осадок, содержащий гидрогеназу, растворяют в 150 мл 0,02 М калийФосфатного буфера, рН 7,0 и полученный раствор прогренают в течение 10 мин при 70 С для удаления термолибильных белков. Денатурированные белки осаждают центриАугировянием в течение 30 мин при 5000 я и для дальнейшей очистки гидрогеназы су-, пернатант наносят на колонку (1,5 х х 15 см) с Аенилсефарозой СЬВ, урав. новешенную 0,8 М раствором сульАатя аммония в 0,02 М калийфосфатном буФере, рН 7,0. Колонку с адсорбированной на ней гидрогеназой промывают вначале 100 мл 0,8 М, а затем тем же объемом 0,2 М раствором сульфата аммония. Гидрогеназу элюируют дистиллированной водой до полной элюции и подвергают повторной хроматографии на колонке с фенилсефарозой СЬВ. Для более тонкой очистки фермент злюируют из колонки понижающимся градиентом концентрации раствора сульАата аммония объемом 100 мл в диапазоне 0,2-0,004 М. Полученные по данной методике препараты гидрогеназы обладают высокой удельной активностью.Характеристики гидрогеназы приведены в таблице.Ацетоновый экстракт упаривают на роторном испарителе под вакуумомупаривают и определяют количество полученных препаратов спектрофотометрически в абсолютном этаноле, используя соответствующие коэффициенты экстринкции.Выход составляет, мг/г сухих клеток:ГидрогеназаУбихинонМенахинон МО Формула изобретения 1 О Преимущества предлагаемого способа по сравнению с известным заключаются в увеличении в три раза выхода фермента, значительном увеличении удельной активности и степени очистки гидрогеназы, в возможности получения из одной порции биомассы дополнительного ряда биологически активных соединений, т.е. при получении определенного количества гидрогеназы, убихинона и менахинона происходит экономия сырья реактивов,энергии, рабочего времени. Кроме Характеристика известному предлагаемому Удельная активность, мкмольН мин мг белкаСтепень очисткиВыход фермента, 7. 28,0350,0 20,0 3,4551,6 6,6 Составитель А. СпундэТехред А.Кравчук Корректор М,Максимишинец Редактор НГунько Заказ 2316/25 Тираж 501 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно в издательск комбинат "Патент", гжгород, ул. Гагарина,10 5 14 лосы с 11 с = 0,5, содержащую убихинон, собирают отдельно, упаривают и рехроматографируют на колонке с окисью алюминия в системе петролейный эфирпиэтиленовый эфир - ледяная уксусная кислота в отношении 90:30:1, Элюат 77741 6того, отсутствие длительных стадийпри очистке гидрогеназы, таких какгель-фильтрация и препаративных 5электрофорез в полиакриламидном гелепозволяют значительно сократить времяполучения гидрогеназы. Способ получения гидрогеназы спроведением воздействия на клетки ТЬосарза гозеорегсзпа штамм ВВБ ультразвука, термообработки, ступен чатого фракционирования сульфатом аммония и очистки фермента, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения выхода и удельной активности гидрогеназы, расширения20 техпологических возможностей и удешевления процесса, перед воздействием ультразвуком проводят обработку клеток охлажденным ацетоном, ступенчатое фракционирование проводят перед 25 термообработкой, а очистку осуществляют двукратной гидрофобной хроматографией на поперечно-сшитом поли мере агарозы с ковалентно присоединенными фенильными группами, способном 30 фракционировать белки с мол.массой61 Оч - 2 10 дальтон.