Способ получения изомальтулозы

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНРЕСПУБЛИК 9) И) 1.:К 5)ИЦ ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН ЫИ т 1. ЕБН ПАТЕН ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМРИ ГННТ СССР(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ УЗОМАЛЬТУЛОЗЬ(57) Изобретение относится к биотехнологии, касается непрерывного преоб Изобретение относится к биотехнологии и касается непрерывного преобразования сахарозы в изомальтулоэу (палатинозу, 6-,00-глюкопираноэид- П-фруктозу) при помощи неподвижных клеток бактерий,Изомальтулоза является промежуточным продуктом для получения глюкопиранозид,6-манита и глюкопиранозид,6-сорбита (изомальтита), которые являются заменителями сахара.Цель изобретения - повышение выхода и чистоты целевого продукта.Для реализации способа с целью получения иммобилизованных клеток осуществляют оптимальное размножение клеток в питательной среде, содержащей только 5 мас.1 сухих веществ.(51) 4 С 12 Р 19/12 // (С 12 Р 19/12, С 12 К 1;425, 1:О 1) разования сахарозы в изомальтулозу инажет найти применение в пищевой промышленности в качестве сахарозаменителя. Цель изобретения - повышениевыхода и чистоты целевого продукта,Способ предусматривает ферментативнуизомериэацию 45-754-ного растворасахарозы путем пропускания его черезреактор с иммобилизованными клеткамиРгогапппо Ьасгег гцЬгшп СВБ 57477 илиЯеггага р 1 упшгЬса АТСС 15928 илиБ. тпагсезсепв ИС 1 В 8285 при 40-65.С.Для иммобилизации клеток в основномпригодны все методы приведения в неподвижность клеток, Благодаря двухступенчатой кристаллизации получаютв кристаллической Форме до 91,5 Фимеющейся в растворе изомальтулазы.7 з.п. Ф-лы. Питательная среда сод стои сироп (промежуточный пр ду харной промышленности, маисовую воду длянабухания и (МЙ) НРО,). Однако предпочтительным является использованиеболее дешевого питательного субстрата, который состоит только из мелассыкормовой свеклы и (ВН) НРО;Для приготовления такого питательного раствора мелассу разбавляют дистиллированной водой ро 54-ного содержания сухого вещества, В качестве дополнительного источника азота и фосфата на 100 кг такого раствора до.бавляют 0,1 кг (НН НРО, Значение рН устанавливают равным 7,2 при помощи натрового щелока, раствора едкого калия или соляной кислоты,3 151248Вакцинация микроорганизма, например РгогаппоЬасг.ег гпЬгп СВБ 574,77,образующего иэомальтулоэу, происходитпри промывке 10 мл стерильного питательного раствора указанного состава,а ферментацию осуществляют в качалочных колбах, заполненных 200 мл этойпитательной среды, при 29 С. Когдаколичество микроорганизмов в загруженной культуре достигает 5 х 10микроорганизмов/мл, культуру переносят в небольшой ферментер с питательной средой указанного состава и далеекультивируют при возможно более высокой степени аэрирования и скоростиоперемешивания при 29 С, Контроль заразмножением осуществляют так же,как и контроль за размножением в качалоцных колбах, путем определениячисла микроорганизмов, Как только колицество микроорганизмов достигнетзначения 5 х 10 микроорганизмов/мл,ферментер освобождают.Для получения иммобилизованныхклеток в основном пригодны все методы иммобилизации клеток 1,СУ 1 ВАТА(1 ппаоЬ 1 кед Епгунез, доЬп И 1 еу апйвопя, Меч,аког, 1.опдоп, 1978),В качестве предпочтительных признаны следующие методы,а) Содержимое для ферментации добавляют либо в сам ферментер, либов другой сосуд с 1/-ным раствооомкатионоактивного коагулянта. Требуемое количество коагулянта должно оыть35определено в предварительном опыте,Клеточную массу, подвергнутую коагуляции, отстаивают, освобождают отлишней воды и далее осадок дваждыпромывают фосфатным буфером 0,1 И,рН 7.0. После этого клеточную массуобезвоживают до получения пастообразного вида, прессуют в полости, сушат,размалывают и просеивают.Ь) К 10 л ферментативного бульонапри медленном помешивании добавляют0,5-2,л 0,2-ного раствора хитозана,(коагулированную клетоцную массупромывают фосфатным буфером О,1 М,рН 7,0, обезвоживают в центрифуге.например с химическим принципом действия или в отстойной, прессуют вполосы, сушат, размалывают и просеи, вают,с) В центрифуге клеточную массуотделяют от ферментационного бульона.5-20 г этой клеточной суспензии (содержание сухого вещества 104) суспен 9 4дирую в 45-60 мл раствора альгината(8 г.в 100 мл) и при помощи шприца(диаметр иглы 0,55 мм) каплями вводятв 23-ный раствор СаС 1 , Появляющиесягранулы примерно 15 мин перемешиваютв растворе СаС 1 и после этого промывают водой, Приблизительно в течение20 ц гранулы сушат при комнатной температуре,с) В центрифуге клеточную массуотделяют от ферментационного бульона,промывают фосфатным буфером (0,1 И,рН 7,0) и подвергают сублимационнойсушке,.При 90 С под флегмой 15 г ацетатацеллюлозы растворяют в 100 мл смесидиметилсульфоксида и ацетона (6:4). После охлаждения до 30 С добавляют3-30 г сублимированных клеток. Этасуспензию при помощи иньекционногошприца (игла 0,8 мм) в виде капельвводят в воду, Образующиеся гранулывысушивают,е) В центрифуге клеточную массуотделяют от Ферментационного бульона.5 г такой клеточной массы суспендируют в .5 мл Физиологицеского раствораповаренной соли при 45-50 С. 1,7 гК-каррагинана (растворимый полисахаридный эфир серной кислоты) растворяют в 34 мл физиологического раствораповаренной соли при 45-60 С. Оба раствора смешивают и в течение 30 миноэту .смесь выдерживают при 10 С, Появляющийся гель Фиксируют в холодном0,3 М растворе КС 1 и потом раскалывают на куски велициной примерно 3 мм.й) Ферментационный бульон смешивают снацала с 1 Й-ным раствором катионоактивного коагулянта, а потом с 14 ным раствором анионоактивного коагулянта либо в самом ферментере, либов другом сосуде. Требуемое количествокоагулянтов должно быть определенов предварительном опыте. Скоагулированную клетоцную массу отстаивают,промывают фосфатным буфером 0,1 М,рН 7,0, прессуют в полоски, сушат,размалывают и просеивают,Клетки микроорганизмов, полученныепо описанным методам, подвергают иммобилизации сшивкой. Рля сшивки применяют бифункциональные препараты,например глутаровый альдегид, Обычнаяконцентрация глутарового альдегида,2,5-5,0 Ф при длительности контакта30-45 мин в случае использованиямикроорганизмов, образующих изо2025 30 5 151мальтулозу, может не соблюдаться,Было обнаружено, что все неподвиж-ные препараты при этих условиях полностью иммобилизованы, В качествеоптимальных условий для образованияпоперечных связей согласно предлагаемому спосоЬу концентрацию глутаровогоальдегида принимают равной 0,13 придлительности обработки 1 О мин.Неподвижные клетки с поперечнымисвязями, полученные по указаннымспособам, подают в колонну реактора,В этом реакторе поддерживают равномерную температуру, а отношение диаметра и высоты составляет 1: 1 - 1:20,преимущественно 1;1 -. 1: 10, предпочтительно 1:1,5-1:5, Чистый растворсахарозы (концентрация 45-754) при40-65 С нагревают через колонну либосверху вниз, лиЬо снизу вверх, Приэтом скорость потока устанавливаюттакой, цтобы время контакта составило1 - 10 ч, преимущественно 4-7 ч (этосоответствует 0,2-0,8 г сахарозы,преимущественно 0,4-0,6 г, на 1 гнеподвижных (сухих) клеток в 1 ч),При этом преобразуется полностью всявведенная сахароза, причем получают13 глюкозы, 44 фруктозы, 823 изомальтулозы и 134 1-0-Ы-В-глюкопиранозирП-фруктозы.Путем простого охлаждения раствораизомальтулозу частично кристаллизуют.При выпаривании и охлаждении из маточного раствора выкристаллизовывается дополнительное количество изомальтулозы, таким образом, в целом из по"лученной изомальтулозы может откристаллизовываться 91,54,В предпочтительном варианте исполнения способа раствор сахарозы пропускают через колонну более быстродля того, цтобы преобразовалось толь"ко 75-803 сахарозы, Часть изомальту-лозы может быть получена в кристаллической форме путем охлаждения потокапродуктов, а остаток после добавлениясвежего раствора сахаровы еще разпропускают через колонну, Преимущество .такого варианта проведения процесса состоит в том, что образование1-0-Ы-В"глюкопиранозид-П-фруктозы подавляется благодаря более короткому.времени контактирования и в итогеможет быть достигнут больший выходизомальтулозы.П р и м е р 1. От заражения штамма РтойашпоЬасет кцЬтшп СВБ 574,77 24896клетки промывают 10 мл питательногостерильного субстрата, состоящего из 8 кг сахарного сиропа, густого, концентрации 653, 2 кг маисовой водыдля набухания, 0,1 кг (ХН) НРО и89,9 кг дистиллированной воды (принеобходимости значение рН устанавливают равным 7,2), Эта суспензия служит в качестве затравочного веществадля предкультуры в колбе объемом 1, л.с 200 мл питательного раствора указанного состава, находящейся вовстряхивающем механизме,После 30-часового инкубированияпри 29 С 16 л питательного растворауказанного состава, разливают по 20колбам (4 л), рассеивают в небольшом30-литровом ферментере и Ферментируют при 29 С при аэрации 20 л в 1 мин и скорости перемешивания 350 об/мин. увеличивающееся количество клеток определяют микроскопическим методом. После того, как число клеток достигнет 5 х 10 клеток/мл, содержимое фер 9ментера переводят в другой сосуд, в котором его смешивают с катионоактивным коагулянтом (например, РК 1 МАРЮС С/Ч фирмы КоЬпНаав,Филадельфия, США), Скоагулированные клетки отстаивают, округляют, промывают Фосфатным буфером (0,1 М, рН 7,0) и обезвоживают на центрифуге. Далее массу экструдируют в полоски, сушат на воздухе и размалывают.Просеянную Фракцию 0,3-0,8 мм из полученного препарата в течение10 мин перемешивают в 0,13-ном раст"воре глутарового альдегира, промываютфосфатным буФером (0,1 М, рН 7,0) и 40 освобождают от надосадочной жидкостипутем декантации, Определение фермен"тативной активности иммобилизованныхклеток дает удельную активность60 ед/г сухого вещества. В термоста" 45 тируемую колонну вводят столько иммобилизованных клеток, чтобы объем слояклеточной массы, составлял 160 смз,Это количество соответствует 60. г су-хого вещества. Колонну затем, нагрева" 50 ют до 50 С и через нее непрерывно про"пускают 70/-ный раствор сахарозы соскоростью протекания 20 смэ/ч, Выходя"щий из колонны поток продукта имеетследующий состав, г/100 г сухого ве 55 щества.Глюкоза 1ФруктозаСахароза, 0Иэоиальтулоза1-0-и.глюкопираноизид-Л-фруктоза 13Полученный раствор изомальтулозыподают в кристаллизатор для охлажрения5одо 20 С и выкристаллизовавшуюся изомальтулозу отделяют от маточного раствора путем центрифугирования на решетчатом барабане. Маточный раствор при70 О С выпаривают ро содержания сухоговещества 80 и снова охлаждают до20 С в кристаллизаторе для охлажде, ния. Выкристаллизовавшуюся изомальтулозу отделяют от второго маточного 15раствора (мелассы) на центрифуге срешетчатым барабаном. Благодаря этойдвухстарийной кристаллизации получают91,5 г, кристаллической имеющейся врастворе изомальтулоэы, 20В 100 кг выходящего из реакторараствора изомальтулозы содержится30 кг воры и 70 кг сухого вещества,из которых 57, кг (823) составляютизомальтулозу. На первой стадии кристаллизации отделяют 32, кг изомаль-.тулозы и примерно 1 кг промывочнойводы добавляют при центрифугировании,Получают 68,6 кг маточного растворас 37,6 кг сухого вещества и 31 кг во- з 0дь, Чтобы этот матс-ный раствор концентрировать от содержания 51,84 сухого вещества до содержания 803 сухо"го вещества до второй стадии кристаллизации, нунно испарить 21,6 кг воды,причем количество снинается на Ц,0 кг35На второй стадии кристаллизацииполучают 20,1 кг изомальтулозьг, таким. образом, общий выход составляет52,5 кг или 91,5 Ф находящейся в эфлю 40ате из реактора изомальтулозы (соответствует 751 используемой сахарозы).Изомальтулоза с первой стадии кристаллизации имеет чистоту более 99,53и может непосредственно использовать-ся далее, Изомальтулоза с второй степени кристаллизации (20,1 кг) имеетчистоту более 96,0 В и ее нужно перекристаллизовывать, Для этого ее снацала растворяют в 13,1 кг воры и за"тем путем испарения и охлаждения выкристаллизовывают,Испаряющееся количество воды составляет 21,6+13,=35 кг для получения52,5 кг изомальтулозы или 0,67 кг/кгизоиальтулозы,55П р и и е р 2. а) От зараженияштамма Ргогатп.поЬасхег пЬхцп СВБ57.77 клетки промывают 10, мл стлрильного питательного раствора, состоящего иэ 6,25 кг свекольной мелассы концентрации 803, 0,1 кг (ОН 3 НРО 4, и 93,65 кг дистиллированной воды (при необходимости значение рН устанавливают равным 7,2 при помощи НС 1). Эта суспензия служит в качестве эатравочного вещества для предкультуры в колбе объемом 1 л с 200 мл питательного раствора укаэанного состава, находящейся во встряхивающем механизме, После 30-часового инкубирования прио29 С 16 л питательного раствора указанного состава, разлитого по 20 колбам ( л), его рассеивают в 30-литровои ферментере и подвергают ферментации при 29 С при аэрации 20 л/мин и скорости перемешивания 350 об/мин,Далее процесс проводят аналогично примеру 1.П р и м е р 3. Из субкультуры штамма Рго 1 ап.поЬасех хиЬг.и СВБ 57.77 клетки смывают 10 мл стерильной смеси 1 ч. сиропа концентрации 653 и 2 ч. водопроводной воды, содернащей 0,5 г/л (1 Н 4) НРО,. Эта суспензия служит в качестве прививочного иатериала для предкультуры в колбах еикостью 1 л с 200 мл питательного раствора указанного состава, стерилизованного 20 мин при 121"С, находящихся в вибрационных машинах. После культивирования в течение 30 ч приа30 С прерварительное культивирование заканчивают. 16 л питательного раствора указанного состава, разлитого по 20 колбам (общий объемл), рассеивают в ферментере емкостью 30 л. ферментируют при 30 С с аэрацией 12 л/иин и при скорости перемешивания 350 об//иин, Выращенные в ферментере 20 л питательного раствора служат в качествепрививочного материала для ферментераемкостью 300 л со 180 л питательного раствора (смесь сиропа с сахарозой и водой с содержанием сухого вещества 25, чистотой 963 в расчете на сухое вещество), Ферментер работает соскоростью аэрации 200 л возруха/минпри 30 С и скорости вращения 200 об//мин,После .7-часовой фазы роста робавляют непрерывно со скоростью разбавления 0,2 ч питательный раствор и рав-се количество превращенного пита тельного раствора с клетками непрерывно удаляют из ферментера, 1512489500 л этого превращенного растворасодержат 2 л клеток (влажные), которые отделяют путем центрифугирования.Концентрация остающегося раствора составляет 23,83 по сравнению с 254 висходном растворе (потери за счет выдувания части сухого вещества). Количество раствора составляет 498 х 1,1001==547,8 кг с содержанием сухого вещества 130,4 кг со 101,7 кг изомальтулозы. После выпаривания до содержаниясухого вещества 803 при 70 С растворохлаждают до 20 С в кристаллиэаторедля охлаждения. Выкристаллизовывающую ся при этом иэомальтулозу отделяютцентрифугированием от маточного раствора.Выхор,55,9 кг изомальтулозы с чистотой примерно 99,0.20Испарение воды на второй стадиикристаллизации 20,4 кг. Всю изомальту. лозу (88,3 кг) перекристаллизовывают,чтобы повысить чистоту до величины свыше 99,5. Для этой цели ее раство" 25 ,.ряют. в 58,9 кг воды, При Кристаллизации затем эту воду нужно снова выпарить.Выход: 85,5 кг изомальтулозы с чистотой более 99,53.Испаряемое количество воды: 385+ +20,4+58,9=464,3 кг=5,43 кг на 1 кг иэомальтулозы.В 500 л исходного раствора содержится 138,2 кг сухого вещества (соответствует 132,7 кг сахарозы), Таким образом, выход изомальтулозы состав",35 ляет 64,4 Ж используемой сахарозы,П р и м е р 4, Фракцию просева 0,3 - 0,8 мм из полученного по примеру 1 препарата размешивают в О,340 ном растворе глутарового альдегида в течение 10 мин, промывают фосфатным буфером 0,1 М, рН 7,0, и путем декантации освобождают от жидкости, Определение ферментативной активности обработанных иммобилизованных клеток45 показывает удельную активность 60 ед/г сухого вещества. Термостатируемую колонну заполняют иммобилизованными клетками, так,чтобы объем клеточной массы составил 16 л. Это 50 количество соответствует 6 кг сухого вещества, Затем колонну нагревают до 50 С и через нее непрерывно пропускают 50-ный раствор сахарозы с нормой расхода 10 л/ч. Выходящий из 55 колонны продукт имеет следующий состав, г/100 г сухого вещества:Глюкоза 1,4 ФруктозаСахароза 0Из омал ь тулоэа 81, 11-0"к-П"глюко"пиранозид-Пфруктоза 3,0Полученный раствор изомальтулозыпри 70 С упаривают до концентрации804, подводят в охлаждающий кристаллизатор, охлаждают до 20 С и выкрис-таллизовывают изомальтулозу на фильтрующей корзиночной центрифуге и отреляют от маточника. Маточник при 70 Супаривают до концентрации 803 и вохлажденном кристаллизаторе вновьоохлаждают до 20 С. Выкристаллизовавшуюся изомальтулозу на аналогичнойцентрифуге отделяют от вторичногоматочника (мелассы).В 100 кг выходящего из реакторараствора изомальтулозы содержится50 кг, сухого вещества, из которых4),55 кг (81,1) составляют изомальтулозу. Упаривают 37,5 кг воды, чтобыповысить концентрацию до 803.На 1-йступени кристаллизации осаждается22,9 кг изомальтулозы и примерно0,5 кг промывной воды добавляют прицентрифугировании. Получают в результате 40,1 кг маточника с 27,1 кг сухого вещества и 13 кг воры, Чтобы перед 2-й кристаллизацией повысить концентрацию маточника от 67,6 до 80,нужно испарить 6,2 кг воды.На 2-й ступени кристаллизации получают 14 кг изомальтулозы, так чтообщий выход составляет 36,9 кг или913 находящейся в реакторе изомальтулозы (соответствует 73,83 использованой сахарозы), Изомальтулоза с 1-йступени кристаллизации имеет чистотуболее 99,5, и ее можно непосрерст"венно применять дальше. Изомальтулозас 2-й ступени кристаллизации (14 кг)имеет чистоту более 96"ь, и ее ещетребуется перекристаллизовать. Дляэтого ее сначала растворяют в 9,5 кгводы и затем путем упаривания и охлаждения выкристаллизовывают,Соответственно этому подлежащееупариванию количество воды составляет37;5+6,2+9,5=53,2 кг для получения36,9 кг изомальтулозы или 1,44 кг/кгизомальтулоэы.П р и м е р 5. Фракцию просева0,3-0,8 мм из полученного по примеру1 препарата перемешивают в 0,13-номрастворе глутарового альдегида в те20 11 15124чение 10 мин, промывают Фосфатным буФером 1,0 М, рН 7,0, и путем декантации освобождают от воды, Определениеферментативной активности у обрабо-,танных иммобилизованных клеток пока 5эывает удельную активность 60 ед/гсухого вещества. Термостатируемую колонну заполняют иммобилизованнымиклетками, так цтобы объем клеточноймассы составлял 16 л. Это количествосоответствует 6 кг сухого вещества.0Затем колонну нагревают до 40 С и через нее непрерывно пропускают 501-ныйраствор сахарозы с нормой расхода10 л/ч, Выходящий из колонны продуктимеет следующий состав, г/100 г сухого вещества:Глюкоза 2,5ФруктозаСахарозаИзомальтулоза 82,51-0-Ы-глюкопиранозид)-фруктоза 9,925Полученный раствор изомальтулозыкристаллизуют по описанной в примере4 схеме,Из 100 кг раствора изомальтулозыполучают 37,4 кг изомальтулозы (соответствует выходу 74,83 в расчете наиспользованное количество сахарозы).Подлежащее упариванию количествоводы составляет 53,2 кг для получения37,4 кг изомальтулозы или 1,42 кг/кгизомальтулозы,П р и и е р 6. От перевивки штаммаЯеххаа р 1 унцЬ:1.са ЛТСС 15928 смывают клетки с помощью 10 мл стерильнойпитательной среды, состоящей иэ 8 кгсиропа с завода по производству саха 40ра, концентрации 653, 2 кг воды отнабухания кукурузы 0,1 кг (ИНл)НРО 1,и 89,9 кг дистиллированной воды (принеобходимости рН устанавливают 7,2),Эта суспензия служит в качестве зат 45равочного материала для предкультурв вибрационных колбах емкостью 1 лс 200 мл питательного раствора указанного состава,После термостатирования в течение 5030 ч при 29 С проводят инокуляциюс помощью 20 колб (4. л) 16 л питатель"ной среды указанного состава в ферментере емкостью 30 л и ферментируютпри 29 С с аэрацией 20 л воздуха/мин 55и при скорости перемешивания350 об/мин, Возросшее количество микроорганизмов определяют микроскопи 89 12ческий методом, После лостижения поменьшей мере 5 х 10 микроорганизмов/млферментацию заканчивают.Содержимое Ферментера переводятв другую емкость (сосуд), где смешивают с катионоактивным коагулянтом(как например, РБ.П 1 АРЬОСС С 7 ФирмыБоев апй Наав, филадельфия, США).Скоагулированные клетки удаляют путемдекантации надосадочной жидкости,промывают с помощью 0,1 М Фосфатногобуфера с рН 7,0 и обезвоживают нацентрифуге, Затем массу экструдируютдо получения прядей, высушивают навоздухе и размалывают,60 г просеянной через сито разме"ром 0,3-0,8 мм Фракции иэ полученногопрепарата в течение 10 мин перемешивают в 0,1 В-ном растворе глутаровагоальдегида, промывают фосфатным буфером 0,1 М, рН 7,0, и декантациейосвобождают от надосадочной жидкости.Определение ферментной активности та"ким образом обработанных иммобилизованных клеток показывает удельную активность 40 ед/г сухого вещества,Иммобилизованные клетки вносят втермостатируемую при 45 С колонну,Объем слоя клеточной массы составляетпримерно 160 смз, Через колонки непрерывно протекает 50-ный растворсахарозы со скоростью потока 70 смз/ч,Выходящий из колонки поток продуктаимеет следующий состав, г/100 г сухого вещества:Глюкоза 3,4фруктоза 5,7Сахароза ,3Иэомальтулоза 74,41-0Э-глюкопиранозид-.Р-фруктоза 15,2Полученный раствор изомальтулозыкристаллизуют соответственно описанной в примере 4 схеме, Из 50 кг раствора изомальтулозы получают 17,3 кгизомальтулозы (соответствует выходу69,23 в расчете на использованноеколичество сахарозы),П р и м е р 7. Ситовую фракцию0,3-0,8 мм из полученного согласнопримеру 1 препарата перемешивают втечение 30 мин в 0,23-ном растворецианурхлорида (2,4,6-трихлор-симм,триазин), промывают фосфатным буфером .0,1 М, рН 7,0 и путем декантации освобождают от надосадочной жидкости,Определение Ферментной активности таким образом обработанных иммобилиэо 1512489 14ванных клеток показывает удельнуюактивность 55 ед/г сухого вещества,В термостатируемую при 40 С колонкувносят столько иммобилизованных клеток, чтобы объем слоя клеточной массы 5составил 160 смз. Это количество соответствует 60 г сухого вещества.Через колонку затем непрерывно пропускают 50 О-ный раствор сахарозы соскоростью потока 30 смз/ч, Выходящийиз колонки поток продукта имеет следующий состав, г/100 г сухого вещества:Глюкоза 2 7Фруктоза 3,9Сахароза 0,7Изомальтулоза 79,91-0-Ы-В-глюкопиранозид 0-фруктозд 12,8Полученный таким образом растворизомальтулозы кристаллизуют соответственно описанной в примере 4 схеме.Из 50 г раствора изомальтулозыполуцают 17,8 кг изомальтулозы. Это.соответствует выходу 71,23 в расцетена использованное количество сахарозы,П р и м е р 8, Из полученного согласно примеру 6 ферментного раствораполучают клеточную массу с помощьюцентрифуги, Эту клеточную массу перемешивают в 8 Ф-ном растворе альгинатанатрия в соотношении 1 ц. клеточноймассы на 10 ч. раствора альгината,Полученную таким образом суспензию 35пропускают через фильеры диаметром0,8 мм в медленно перемешиваемый 24 ный раствор хлорида кальция, При этомобразуются гранулы (шарики) альгината кальция, которые содержат включенные клетки бактерий, Измерение ферментной активности гранул (шариков)показывает удельную активность 87 ед/гсухого вещества., В термостатируемуюпри 40 С колонку вносят 160 смз гранул (шариков). Это количество соответствует 45 г сухого вещества. Черезколонку непрерывно пропускают 50-ныйраствор сахарозы со скоростью потока50 смз/ч, Выходящий из колонки поток 50продукта имеет следующий состав,г/100 г сухого, вещества:Глюкоза 2,1Фруктоза 4,3Сахароза 20 -, 55Изомальтулоза 78,31 0 о Р глюкопирднозид-П-фруктоза 13,3 Полученный раствор изомальтулозыкристаллизуют соответственно описанной в примере 4 схеме.Кз 50 кг раствора изомальтулозыполучают 17,6 кг изомальтулозы. Этосоответствует выходу 70,4 в расчетена использованное количество сахарозы.П р и м е р 9, Перевивку штаммаРгоапппоЬасег гпЬгцш СЬБ 574,77ферментируют аналогично примеру 6.Содержимое ферментера смешиваютс 24-ным раствором хитозана. Скоагулированную при этом клеточную массуобеэвоживают на центрифуге, экструдируют до полуценния прядей и высушивают. Затем массу размалывают и просеивают, Ситовую фракцию 0,3-0,8 мм перемешивают в течение 30 мин в 0,2-номрастворе цианурхлорида (2,4,6-трихлор-симм.-триазин) промывают фосфатным буфером О,1 М, рН 7,0, и. отделяют от надосадочной жидкости декантацией,Определение ферментной активностиобработанных таким образом иммобилизованных клеток показывает удельную активность 65 ед/г сухого вещества. В термостатируемую при 40 С колонкувносят столько иммобилизованных клеток, чтобы объем слоя клеточной массысоставил 160 смз, Это количество соответствует 50 г сухого вещества. Черезколонку затем непрерывно пропускают50-ный раствор сахарозы со скоростью потока 60 смз/ч. Выходящий из колонкипоток продукта имеет следующий состав, г/100 г сухого вещества:Глюкоза 1,3Фруктоза 3,2Сахароза 1,2Изомальтулоза 80,61-0-Ы-Б-глюкопиранозид-В-фруктоза 13,7Полученный раствор изомальтулозыкристаллизуют соответственно описанной в примере 4 схеме.Из 50 г раствора изомальтулозыполучают 18, 1 кг изомальтулозы, Этосоответствует выходу 72,М в расчетена использованное количество сахарозы.П р и м е р 1 О. Перевивку штамма РгогашпоЬасгег гцЬгцш СББ 574,77 ферментируют аналогично примеру 6.Содержимое ферментера переводят в другой сосуд, смешивают с водным раствором коагулянта, состоящим иэ катионоактивного коагулянта РКХМАР 1 ОС С 7 фирмы КоЬш апй Наав, филадельфия,США) и ан(ионоактивного коагулянтаф 1РК 1 МЛ 1"1.0 СА 10 фирмы Ко 1 тщ апс 1 Наая,Филадельфия П 1 А, Скоагулировавшиеклетки осаждают, декангируют, промывают с помощью 0,1 М Фосфатного буфера, рН 7,0, и обезвоживают на центри"фуге. Кассу затеи экструдируют,вжгуты, сушат при 30 С и размалывают100 г ситовой Фракции 0,3-0,8 ммполученного препарата перемешиваютв течение 10 мин в 0,13-ном раствореглутарового альдегида, промывают фосфатным буфером (0,1 Н, рН 7,0) и путем декантации освобождают от надосадочной жидкости, Обработанные клеткиимеют удельную активность 65 ед,/гсухого вещества,510 15 Иммобилизованными клетками запол няют термостатируемый при 30 фС коло" ночный реактор. Объем слоя клеточной массы составляет примерно 300 смз. Через реактор непрерывно пропускают 503-ный раствор сахарозы со скоростью протекания 180 смз/ч. Выходящий из25 реактора поток продукта имеет следую-. щий состав, г/100 г сухого вещества:Глюкоза 3,1фруктоза 1 9Сахароза 0,8.30Изомальтулоза 81,51-0-о-В-глюкопиранозидо)-фруктоза 9,7Полученный раствор изомальтулозы кристаллизуют соответственно описанной в примере 11 схеме.Иэ 50 кг раствора изомальтулоэы получают 18,3 кг изомальтулозы, Это соответствует выходу 73,23 в расчетена использованное количество саха розы.Изобретение обеспечивает следующие преимущества: раствор, содержащий изомальтулозу, можно подвергать крис" 45 таллизации без предварительного выпаривания, благодаря чему достигается значительная экономия энергии; применение иммобилизованных клеток повышает выход изомальтулозы, так как сахароза не расходуется для обмена ве" ществ бактериальной массы; выход изомальтулозы еще более повышается вследствие того, что вводят чистые растворы сахарозы и поэтому избегают обширного образования мелассы; так как растворы сахароэы с концентрация" ми выше 654 микробиологически стабильны, то можно исключить стерилиэацию субстрата; более высокие концентрации субстрата можно вводить в мень-. шем объеме и, таким образом, можно использовать аппаратуру меньших размеров; увеличение бактериальной массы для получения неподвижных клеток происходит при оптимальных условиях развития; для приготовления бактериальной массы можно применять деше" вый питательный субстрат, например разбавленный мелассовый раствор.формула изобретенияСпособ получения изомальтулозы,предусматривающий ферментативную изомеризацию раствора сахарозы с помощьюклеток РгоаппттоЬасгег гцЬгцтп СВБ574.77 или Беггай.а р 1 ущттг 1 тгса с пос"ледующим выделением и кристаллизациейцелевого продукта, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью повышения выхода и чистоты целевого продукта, изомеризацию осуществляют с использованием иммобилизованных клетоккультур Ргогащй.ттоЬасгег гцЬгцщ СВБ574.77 или Беггай.а р 1 утпттгЬса АТОС15928, или Б, тпагсеясепя ИС 1 В 8285путем непрерывного пропускания 1575 ь-ного раствора сахарозы через реактор с иммобилизованными клеткамипри 10-65 С.2. Способ по п,1, о т л и ч а ю -щ и й с я тем, что используют иммобилизованные клетки, полученные коагуляцией глутаровым альдегидом илихлористым циануром,3. Способ по и.1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что используют иммобилизованные клетки, полученные коагуляцией катионоактивным коагулянтом,Способ по пп.1 и 3, о т л ич а ю щ и й с я тем, что в качествекоагулянта используют хитоэан,5. Способ по п.1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что используют иммобилизованные клетки, включенные в матрицу из альгината"кальция,6. Способ по п.1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что используют иммо"билизованные клетки, включенные в1(-каррагинановый гель.7. Способ по п.1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что используют иммо"билизованные клетки, включенные вволокна диацетат или триацетат цеЛлюлозы,8. Способ по п,1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что используют иммо 17 1512489 18билизованные клетки, полуценные коа" активным коагулянтом или их комбинагуляц 1 ей анионоактивным или катионо- циейСоставитель И,ПриваловаРедактор А.Огар Техред Л.Сердюкова Корректор В,КабацийЗаказ 5914/59 Тираж 501 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101