Способ получения модифицированного кремнеземного носителя для иммобилизации биоспецифических лигандов

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИН147 51)4 В 01 ЕНКЫЙ КОМИТЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТ ССР ОСУДАРС О ИЗОБР РИ ГКНТ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ-405, 19 емы вафин. /Химия ванные кремн зе и хромато сичкина. - М орб Под ред1986 4415633. Па кл. 42 обавляют 1,3 мл т 1 мономеров), Пригот помещают в предвар ный 180 ." макропорц иаметром пор 23001 верхностью 28 м"г м 0,01 м, Реакццо шивают в течецие 5 т раствор ц нагрев ю смесь до 70 С, В;Од ЯР ительно заг н стого стек (гА ц удельреактор ццую смесьмцц, Ваку ают реакои по е ерем миру о течение прова опали и кре тилло я ц кремцезецяццц при,:.1 т г 1 рячимятц.м буфе 1 П 1 ц сушат модификсц м. Ла к ем црамцв идам, ф а ер вивк диме ром н ц оя ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОДИФИЦИРОВАННОГО КРЕМНЕЗЕМНОГО НОСИТЕЛЯ ДЛ 51 ИММОБИЛИЗАЦИИ БИОСПЕЦИФИЧЕСКИХ ЛИГАНДОВ Изобретение относится к способу получения полимеризационно-модифицированных кремнеземов и может быть использовано для иммобилизации биоспецифических лигандов,Цель изобретения - снижение. неспецифической сорбции белков и упрощение способа.П р и м е р 1. В 5 г сухого диметилформамида растворяют 7,1 г акриламида (0,1 моль), в 400 мл бензола растворяют 0,318 г лаурилпероксида и 19,3 г (0,1 моль) п-нитрофе-. нилакрилата. Растворы при перемешивании смешивают, Затем к этому раст(57) Изобретение относится к способам получения модифицированного крем- неземного носителя для иммобилизации биоспецифических лигандов и позволяет снизить неслепифическую сорбцию белков и упростить способ. Макропористый кремнезем с диаметром пор 50-230 нм смачивают 3-10%-ным раствором сомономеров в органическом растворителе (6-22% от массы кремнезема) при этом сомономеры - п-цитрофенилакрилат и акриламид - берут в мольном отношении от 1:3 до 3:1. В смесь добавляют диметакрилат олигоэтиленгликоля (ТГМ-З, ТГМ) в количестве 5-10% от массы мономеров и лаурилпероксид в количестве 0,5-2% от массы мономеров. Реакциоццую смесь перемешивают, вакуумируют, нагреваютодо 70 С и выдерживают 3 ч. Продукт промывают диметилформамидом, этанолом и высушивают. 1 табл,477439ня лиофильной сущке. Последующая обработка мплиЬицировянного кремнезема 25 -ным раствором водного аммиака дает содержание 90 мкмоль и-нитрофенилакрилатных групп ня 1 г твердой Фазы. Ход реакции контролируютспектроАатаметрически при мак;.=405 нм, Аиксируя количество выделяющегося нитроАеноля.ОП р и м е р 2, Синтез носителяпроводят по примеру 1, но на 19,3 гп"нитрофеннлакрилата (0,1 моль) берут 21,3 г акрнламидя (0,3 моль),а лаурилпероксиц берут в количестве0,8 г, содержание и-нитрофенилакрилатных групп составляет 20 мкмольна 1 г твердой Аазы.П р и м е р 3. Синтез носителяпроводят по примеру 1, но на 19,3 г(10% от массы мономеров). Содержаниеи-нитрофенилякрилатных групп составляет 60 мкмоль на 1 г твердой Фазы,П р и м е р 4. Сингез носителя проводятпо примеру 1, но на 19,3 г и-нитрофенилакрилата (0,1 моль) берут35,5 г акриламица. Содержание и-нитроАенилакрилатных групп составляет2 мкмоль на 1 г твердой фазы,П р и м е р 5. Синтез носителяпроводят по примеру 1, но на 19,3 ги-нитрофенилакрилата (0,1 моль) берут 1,4 г акриламида. Содержание и 35нитрофенилакрилатных групп составляет 10 мкмоль на 1 г твердой фазы.П р и м е р 6. Синтез матрицы проводят по примеру 1 но берут 3,5 гакриламида и 19,6 г п-нитрофенилакрилата, а вместо 1 мл ТГИдобавляют 1 мл ТГМ, Содержание п-нитрофенилакрилатных групп составляет80 мкмоль на 1 г твердой Аазы,45П р и м е р 7. МодиАикация кремнезема сополимером акриламида и инитрофенилакрилата с соотношениемсомономеров 3:1.Синтез проводят по примеру 2, ноТГМдобавляют в количестве 6 г(152 от массы мономеров), Содержаниеи-нитрофенилакрилатных групп составляет 30 мкмоль на 1 г твердой фазы.П р и м е р 8. Для блокирования55активированных групп и последующегоопределения неспециАической сорбциибелков 1 г носителя, полученногопо предлагаемому способу, прибавляют в 10 мл 5 -ного раствора этяноламиня в диметилформямиде и перемешивают при встряхивании 24 ч. Раствор этаноламиня декантнруют, инактивированный носитель промывявт 3 раза по 50 мл 0,05 М натрийфосфатного буфера (рН 7,0), содержащего 0,1 М ИаС 1 и помещают в колонку размером 16 см. Неспецифическую сорбцию ( -химотрипсина и альбумича определяют в указанном буАере при нанесении 3 мг белка в 0,3 мл буфера. Злюируют со скоростьв 0,5 мл/мин. Сорбцив цито- хрома-С определяют в условиях известного способа: 0,02 М фосфатный буфер, рН 9,0. Колонка 134 см, проба белка 1 мг в 0,1 мл буфера. Содержание белка в элюате определяют по Кумасси. В таблице представлены сравнительные результаты.П р и м е р 9. Определение емкости активированного носителя по иммуноглобулину С, К 1 мл 10%-ного раствора иммуноглобулина С человека прибавляют 4 мл бикарбонатного буАера (0,3 М раствора ИаНСО, содержащего 0,1 М МаС 1), К полученному раствору прибавляют 1 г активированного носителя, встряхивают и инкубируют 24 ч нри 4 С. Затем носитель промывают на пористом Аильтре 50 мп бикарбонатного буАера, Аильтрат диализуют против того же буАера, после чего измеряют его объем и оптическую плотность при Я = 280 нм (Л, ), 1 мл 10%- ного раствора иммуноглобулина разбавляют бикарбонатным буфером до объема Фильтрата и измеряют оптическую плотность при Ъ = 280 нм (Л), Емкость активированного носителя рассчитывают по ФормулеЛС = 100 тгЛВеличины неспециАической сорбции белков на носителях по примерам 1-7 и емкость носителей по иммуноглобулину С представлены в таблице.Носитель, полученный по предлагаемому способу, позволяет иммобилизовать значительные количества белка (до 65 мг/г носителя), обладает при этом низкой неспецифической адсорбцией белков (0,2-0,3 мг/г носителя) и может служить исходной основой для получения больного количества афин" ных сорбентов. Кроме того, носитель обладает всеми преимуществами твер477439бпри их молярном соотноюенни (1-3)::(3-1) в присутствии снивающего агента - диметакрилата олигоэтиленгли 5коля а в качестве инициатора полиФмериз ации используют лаурилпероксид,Емкость Неспецифическаясорбция, мг/г При 10 меР по иммуноглобулину,мг/г Аль- Хим булян отрииула изобретения Способ получения модифицированного кремнеземного носителя для иммобилизации биоспецифических лигандов, включающий обработку макропористого кремнеземного носителя раствором сомономеров и-нитрофенилакрилата и амида акриловой кислоты с последующей полимеризацией сомономеров в присутствии инициатора, о т л и ч а ю - щ и й с я тем, что, с целью снижения неспецифической сорбции белков и упрощения способа, кремнезем обрабатывают раствором сомономеров 65 60 65 1065 20 Известный но ситель -0 Составитель Т.ЧиликинаРедактор Н.Тупица Техред М,Дидык Корректор З,Лончакова Заказ 218 Тираж 600 П енного комитета по изобретениям и о 13035, Москва, Ж, Раушская наб исно ытиям при ГКНТ С 4/5 НИИПИ Государс зводственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гага 01 1 докаркасных хроматографических материалов - высокой механической ностью, ненабухаемостью в органических растворителях, устойчивостью к действию микроорганизмов и, следовательно, может быть использован в массивных колонках с высоким давлением и высокой скоростью потока элюента. 0,2 0,2 0,3 0,3 1 ф 5 0,2 1,2