Способ получения l-карнитина

СОВЕТ СНИХ савЛлаки БЛИНОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИН ПАТЕНТУ тина. Цель изобретения выхода.Ь-карнитина. Это тем, что бактериальный цента выращивают на пит де, содержащей в качест углерода и азота т-бут кротонобетаин, факторы виях аэрации до максим ления целевого продукта щим его выделением, в к риального штамма продуц зуют А 8 гоЬасгегшш НК 4 йегшш НК 13, или АягоЬ НК 1331, при этом т-б или кротонобетаин вводя ве 0,1-10,0%. 0 еллехки (СН) Рагшайгоп1 п 1 п Рвеиу, 1967, . НИЯ Ь-КАР ВИТИНАосится к бйотехолучения Ь-карниОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ ОССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНР 1 ТИЙ,нологии и касается и- повышение достигается ,штамм продуательной сре- зе источника иробетаин или роста в услоального накопс последуюачестве бакте" ента испольили АягоЪасас 1 егшш утиробетаин т в количест1435159 Описание штамма АягоЪасйегЫш НК 4 (РЗМ В 2938): Образованиефенилаланиндеаминазыорннтйндекарбоксилаэы Форма клеток палочки,частичноплеоморфны 1-2 0,5-0,8Длина, мкм Ширина, мкм Подвижность Жгутикование перитрихальное Использование субстрата ацетата Изобретение относится к биотехнологии н касается получения Ь-карнитина.5Целью изобретения является повышение выхода Ь-карнитина,Способ заключается в следующем.Предлагаемые микроорганизмы .способны вырабатывать иэ кротонобетаинаили г-бутиробетаина Ь-каринтии, не 10разлагая последнего. Все эти микроорганизмы могут быть продуцентамипри том условии, что они мутированыпо следующему двухстадийному методуселекции; 15а) микроорганизмы, выращияаемыена бетаине, у-бутиробетаине, крото"нобетаине и Ь-карннтине в качествеисточника углерода и азота, мутируютизвестными приемами; 20б) из культуры мутированных микроорганизмов, полученной в результатепроцесса культивирования, селекцноии"руют устойчивые микроорганизмы, неразлагающие Ь-карнитина и выращнвае-. 25ьве на бетяине., кротобетаине, бутиробетаине. Выращивание штаммов,растущих на бетаине, кротонобетаине,Реакцияпо Граму СпорыОбразованиеполи-.оксибутирата оксидазыкаталаэы .Роств анаэробных условиях37 С41 фСрН 5,6на агаре МасСогКеуна агаре ЗЗна цетримндномагаре у-бутиробетаине в качестве источникауглерода и азота, осуществляют путемпосева смеси бактерий на.кротонобетаиновые питательные растворы, приготовляют таким образом смешанныекультуры, а затем по традиционныммикробиологическим приемам получаютчистые культуры разлагающих кротонобетаин микроорганизмы. Мутацию культур, растущих на )-бутиробетанне,кротонобетаине в качестве источникаазота н углерода, осуществляют известными методами. Мутированные такимобразом микроорганизмы подвергают селекцнонированию,Микроорганизмом растущим набутиробетаине или кротонобетаине вкачестве источника углерода и азота,является штамм НХ 4 (РЗИВ 2938) иего десценденты и мутанты, Этотшгамм 03.03.84 за Р РЗМ 2938 бып депонирован при Немецкой коллекции мик-.роорганизмов (ВецСзсЬе АЗашш 1 ц 68 акопМЖгоог 8 апхзшеп (РЗМ) при обществеСезе 11 всЬаЮй Ебг ВойесЬпо 1 о 8 зсЬеГогзсЬж 8 шЪН, СгеаеЪасЬзйгаЪе, 84300 СоййЫ 8 еп, ФРГ). Н,ЗРеакция Фогес-ПроскауераОбразованиеиндоланитрата иэ нитратаДенитрификацняОбразованиелеваналецитиназыуреазыДеградациякрахмалажелатинакаэеинатирозинатвина 80ДНКэ скулина143559 Пигментыне диффундирующнедиффундирукщиефлуоресцирующиеОбразование кислоты(тест "ОР") изглюкозы аэррбноанаэробнофруктозы аэробноАБЯ глюкозыксилозытрегалозыэтанола.Образование газа изглюкозыОИРСОбразованиеаргининдигйдролазылизиндекарбоксилаэы нитратамалоната глицина.норлейцинаксилозыфруктозыглюкозы Автотрофный ростна Н 13-кетолактозаРост набетаинеЬ-карнитнне-бутиробетаинекротонобетаине Описание штамма АягоЪасйегегдпщ НК 13 (ЭБМ я 2903) Образованиефеннлаланнндеаминазы орнитиндекарбоксилаэы Форма клеток палочки частичноплеоморфны.1-20,5-0,8 Длина, мкм Ширина, мкм Подви:кность Жгутиковые Реакция Фогес-ПроскауераОбразованиеиндоланитрита из нитратаДенитрификацияОбразованиелеваналецитиназыуреазы перитрихаль"ное Реакция по Граму СпорыОбразование поли-оксибутирага оксидазы каталаэы Рост Деградация крахмала в анаэробных условиях37 С41 фСрН 5,6на агаре МасСопЕеуна агаре БЯ на цетримидном агаре желатинакаэеина тирозинатвина 80ДНКэскулина Микроорганизмом, полученным в ре- штамм 23,01,84 был передан общестэультате мутации и селекцнонирования ву Сеяе 11 ясЬайг Ыг ВойесЬпо 1 о 8 дзсЬе из указанного микроорганизма, который ТогяеЬпп 8 щЬН, Ьг 1 еяеЬасЬзйгаЬе 8, обладает устойчивостью, не, разлагает 26 4300 Сбггпяеп, ФРГ, на хранение за Ь-карнитина, а вселяет его и растет У ПБМ 2903 в коллекции РеигясЬе Яащна кротонобетаинеили т-бутиробетаине, щ 1 цп 8 чоп МЖгоог 8 ап 1 ящеп (ЭЯМ) .является штаммАягоЬасйегииа НК 13.Этот1435159 Продолжение колонки 1 Продолжение колонки 2 Описание штамма А 8 гоЬасгегштп НК 1331 (ОБМ Р 3225): Образованиефе нилала ниндеаминазыорнитиндекарбокси-лазыН.БРеакция Фогес-Проскуера Образованиеиндоланитрнта из нитрата Денитрификация форма клеток палочки частично плеоморфны 1-2О, 5-0,8+перитрихаль- ное Длина, мкм Ширина, мкм Подвижность Жгутик ованне ОбразованиелеваналецитиназыуреазыДеградация.крахмалажелатинаказеина Пигментыне диффундирующиедиффундирующиефлуореспирующиеОбразование кислоты(тест "ОР") изглюкозы аэробноанаэробнофруктозы аэробноАББ глюкозыксилозытрегалозыэтанолаОбразование газа изглюкозыОЫРСОбразованиеаргининдигидролазылизиндекарбоксилазы Примером устойчивого десцендента микроорганизма НК 13, не разлагающего, а выделяющего Ь-каринтии и растущего на бетаине, Ь-глутамате и кротонобетаине, Ь-глутамате и бутиробетаине, глутамате и Ь-карнитине является штамм НК 1331. Его выделяли в виде спонтанно и хорошо растущей ко-ф ловки мутантов с поверхности плотной Реакция по ГрамуСпорыОбразованиеполи-оксибутиратаоксидазыкаталазыРост в анаэробныхусловиях370 С41 СрН 5,.6 Использование субстратаацетатацитрата. малонатаглицннанорлейцинаксилозыфруктозыглюкозыАвтотрофный ростна Н,3-кетолактозаРост набетаинеЬ-карнитинеу-бутиробетаине .кротонобетаинеЬ-глутамате икротонобетаинеЬ-глутамате ибутиробетаинеЬ-глутамате иЬ-карнитине агаровой питательной среды, содержащей Ь-глутамат и р-бутиробетаин.Указанный штамм 08.О 2.85 был передан обществу ЬезеПзсагг, Гйг ВоесЬпо 1 о 8 зсЬе РогзсЬипя шЬН, Ьгеве, ЬасЬзггаЬе 8, 43 ОО, СоЫЫ 8 еп, ФРГ, на хранение за У ВБМ 3225 в коллекции 0 епсзсЬе Башш 1 ппя акоп МЖгоог 8 апхвшеп (1 БМ) .гПродолжение коЛонки 1 на агаре ИасСоцКеуна агаре ЯБна центримидном агаре Пигментыне диффундирующие диффундирующие ФлуоресцнрукициеОбразование кислоты(тест "ОГ") изглюкозы аэробноанаэробноФруктозы аэробноАБЯ глюкозыксилозытрегалозыэтанолаОбразование газа изглюкозыОЫРСОбразование,аргининдигидролазылизиндекарбоксилазы435159Продолжание колонки 2 тир озинатвина 80ДНКэскулинаИспользование субстратаацетатацнтратамалонатаглицинанорлейцинаксилоэыфруктозыглюкозыАвтотрофный ростна Н 13"кетолактозаРост набетаинеЬ-карнитинеВ целях осуществления предлагаемого способа получения Ь-карнитина целесообразно сначала выращивать предварительную культуру микроорганизма на стерилизованной среде при 20-40 фС при рН 6-8 в течение 20-50 ч. Эта предварительная культура должна содержать в качестве субстрата роста О, 1-10 мас,Х -бутиробетаина и кро. тонобетаина, считая на реакционную среду.-Бутиробетаин или кротонобетаин можно использовать в виде гидрохлоридной соли, свободной внутренней соли или их производных. С помощью приготовленных по данному способу предварительных культур можно засевать питательные среды. Последние должны иметь такой же состав, что 0 и предварительные культуры посевного материала. Концентрация подвергаемых реакции крстонобетаина, т-бутиробетаина или смесей этих соединений в питательной среде 0,1-10 мас.Х. Суб страты роста - холин, глутамат, ацетат, диметилглицин и бетаин - целесообразно применять тожЕ в концентрациях, соответствующих концентрациям в предварительной культуре.Клетки можно отделять центрифугированием или Фильтрованием и использовать в качестве посевного материала для приготовления новой культуры. Образовавшийся Ь-карнитин путем катионообменной хроматографии выделяют из всплывающей жидкости и очищают перекристаллизацией.П р и м е р 1Выделение разлагающего кротонобетаин микроорганизма.Из почвы нейтральным раствором Фосфатного буфера с перемешиванием извлекают микроорганизмы с последующим отделением крупных компонентов через фильтровальную бумагу, С помощью полученной таким образом смеси бактерий засевают питательный крото" нобетаиновый раствор до легкого помутнения, Через 9 сут помутнение, являющееся мерой концентрации клеток, увеличилось в 90 раз. В результате кротонобетаин в растворе уже не обнаэчкивался и в нем в качестве про143515 10 9ухта деградации докаэывались аммоевые ионы, Из укаэанной смешаннойльтуры, прибегая к традиционнымкробиологическим приемам с исполь 5ованием плотной агаровой питатель"ой среды, приготовляют чистые кульуры разлагающих кротонобетанн ьйкроганизмов. Для проведения дальнейх работ иэ них выбирают культуру, 10бозначаемую АгоЬасйегегцш НК 4.от штамм растет на у-бутиробетаие, Ь"карнитине и бетаине.П р и м е р 2. Выделение устойчи;ого не содержащего дегидрогенаэуарнитина мутанта.Культуру штамма АВгоЬасгегегнив4 с помощью мутагена АсгЫЫ Ииааеп 1 СК 191 (5 мкг/мл) в сукцннатой среде подвергают стабильной муагенизации, после чего клетки в цех экспрессии мутацни выращивают натательном бульоне, затем переводят,бетаиновую среду. Промытую культу"у Вносят в Ь карнитиновую средуе 25же через несколько часов культура,ступала в логарифьвческую фазу рос"а. В это время добавляют пенициллин(15 .мг/мп) и Э-цяклосерин0,5 мг/мп), которые в качестве провоселекцнонирующих агентовумерщвют только растущих бактерий, В результате выкивания накапливались муанты, которые не могли расти на-карнитийе, Через 30 ч число живых клеток сокращалось в 100 раз, После 35 отмывки антибиотиков культуру переводят в бетаиновую среду. Выросшую культуру разбавляют и распределяют на плотной питательной среде. Отдельные клетки вырастали с образованием колоний и, в отдельности подвергались ,испытанию. В результате выбирают му" такт АягоЬасгегегьцш НК 13. Последний устойчив, не содержит дегидрогенаэы карнитина и растет на бетаине. Прорастая на бетаине, диметилглицине, хопине, глутамате или ацетате, этот штамм превращает кротонобетаин нли -бутиробетаин в Ь-карнитин и выделяет его.50П р и м е р 3, Предварительную культуру штамма АягоЪасйегегдиш НК 13 объемом 5 мл культивируют в течение 32 ч при 30 С и рН 7,0 в витаминсодержащей минеральной среде, содержа щей 1 мас.7. бетаина и 0,5 мас.Х кротонобетаин-хлорида, Эту культуру эасеивают в культуру того ае состава объемом 15 л, которую потом выращивают в течение. 24 ч в условиях, указанных для предварительной культуры.По прекращении получения Ь-карннтинаудаляют клетки центрифугированием иприменяют их затем в качестве посевного материала для приготовления новой культуры. Энзиматическим анализом определяют концентрацию Ь-карнитина во всплывшей жидкости (19,8 л).Содержание Ь"карнитнна во всплывшей жидкости 4,26 мг/мп, что составляло по выходу 95,03. Путем катионообменной хроматографии выделяют Ькаринтии из всплывшей аидкости и очищают его перекристаллизацией.П р и м е р 4, Предварительнуюкультуру штамма АВгоЬасгегегдош НК 13объемом 5 л культивируют в течение32 ч при 30 С и значении рН 7,0 ввитамннсодераащей минеральной среде(по примеру 1), содержащей 1 Ж холинаи 0,63 -бутиробетаин-хлорида. Этукультуру эасеивают в культуру со средой того же состава объемом 15 л, ко"торую потом выращивают в условияхпримера й. По прекращении полученияЬ-карнитина (примерно через ЗО ч) отделяют клетки методом юкрофильтрацние Клеточную массу используют длядальнейшего получения Ь-карнитина.Концентрацию Ь"карнитина в фильтрате(19,6 л) определяют энэиматическиманализом. Содержание Ь-карнитина вфнльтрате 5,3 мг/мп. Это соответствовало аналитическому выходу в 97,6 Х,считая на использованное количество1-бутиробетаин-хлоридаП р и м е р 5. Предназначенный с.для приготовдения непрерывной культуры ферментер, содержащий 1,5 л витамннсодераащей ьянеральной среды (попримеру 1) с 1,53 бетаина и 1,0 Ху-бутиробетаин-хлорида, загружают150 мп предварительной культуры А 8 гоЬасгегегдош НК 13 на той же среде.После азробного выращивания в течение 20 ч при 30 С и рН 7,0 культурадостигала полного роста. Потом клейки отделяют путем центрифугирования.Согласно энэиматическому анализувсплывшая жидкость содержала 8,8 гЬ-карнитина на литр культуры. Следует отметить, что количество 0,1-103 является существенным, так как только в этом случае достигается повышение выхода. При количествах1 435159 12 выше 103 будет иметь место осмотическое давление клеток.Данный способ позволяет повысить выход Ь-"карнитина на 153.формула изобретения Составитель Е.БуданцеваТехред М.Моргентал Корректор С.Шекмар Редактор О.Спесивых Заказ 556959 Тирах 520 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений н открытий113035, Иосква, Ж, Раущская наб., д. 4/5 ююаееа еюв аеюююююююююююююююююююююююювююююююю юаюююю Производственно-полиграфическое предприятие, г. Уагород, ул. Проектная, 4Способ получения Ь-карнитина, предусматривающий выращивание бактери ального штаммаюпродуцента на питательной среде, содераащей в качестве источника углерода и азота т-бутиее робетаин или кротонобетаин, факторы роста в условиях аэрации до максимального накопления целевого продукта с последующим его выделением, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что,1 с целью повышения выхода 1-карниткна, в качестве бактеркального штаммаюпродуцента используют АягоЬасйегьцш НК 4, кли АягоЬасйег 1 ца НК 13, или АягоЬассегшщ НК 1331, при этом бутиробетаин нли кротонобетаин вводят в количестве от 0,1 до 10,03.