Способ получения пептидов

(1% (П СПУБЛИН К 37/О 5,1 ) 4 С 0 7 К 7 2 НИЕ ИЗОБРЕТЕНИ 21) 3791983/23-0 22) 12,09.84 31) 532170; 5450 32) 13,09.83; 25 8 ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ(71) Дзе Салк Институт фор Биолоджикал Стадиз (цБ)(72) Жан Эдвард Фредерик Ривье (СН)и Вили Уолкер Вейл, МЛ (цБ)(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДОВ(57) Изобретение касается пептидов,в частности соединений общей ф-лы 1К,-А 1 а-Аяр-А 1 ае-РЬе-ТЬг-К-БегТуг-,Агя-К-К,-Ьец-С 1 У-С 1 п-К,4-К (8 - .А 1 а-.Ага-Ьуя-Ьец-К -К 24-Кя -Т 1 е-Б 1 еК-Аг 8-МН где К- РМе-Туг илиН 1 яу К 8 - Бег или АяпФ КИ - Агиили ьуя; к ( - 11 е или ча 1; к 4Ьец или Р-Ьец; К- Туг или Бег;К- Ьец или В-Ьец; К 4 - Нгя илиС 1 ц; К- С 1 ц или Р-С 1 ц или Аяр;К - Аяц или Бег, которые обладаютспособностью промотировать выделениегормона роста, что может быть использовано в сельском хозяйстве Цельизобретения - создание новых болееактивных и менее токсичных пептидов,Их синтез ведут из защищенного группой ВОС или ТОС аргинина, которыйсвязывают с метилбензгидриламиновойсмолой (МБГАС) с последующим отщеплением группы ВОС. Затем проводят последовательное наращивание пептиднойцепи в указанной в ф-ле 1 последовательности с использованием 1-2 ммользащищенной аминокислоты на 1 г смолыМБГАС. Процесс ведут в среде диметилформамида и/или метиленхлорида Получают пептидную смолу общей ф-лы 11.Х -К,(Х)"или Х-А 1 а-Аяр(Х з)-А 1 аеРце - Тйг(Х 4)-К(Х 4 или Хя)-Бег(Х 4)"Туг(Х 2) -Аг 8 (Х) -К,(Хили Х) -К,-Ьец-С 1 УС 1 п (Х ) -К ( -К(Х ) -А 1 а-Агд (Х)- Ьуя (Х ) -Ьец-К гэ К 4 (Х 4 или Х)- К Я(Х 3)-1 1 е-Х 1 е - К(Х 4 или Х)-Аг,ИН-Л, где К -Кя, К ( о, К т Кь- указаны; Х 4=Н или ВОС; Х =Нили 2,6-дихлорбензоил; Х =Н или ОВЕ 1;Х 4=Н или бензил; Х=Н или ксантил;Х=Н или тозил; Х=Н или 2-хлорбензилоксикарбонил; Е=ВНА или МВНА. В этойсмоле отщепляют защитные группы и полимерную подложку обработкой СР СООНили НР при (-20)-0 С в присутствиианизола и/или метиленсульфида.- Целевой продукт выделяют с помощью жидкостной хроматографии высокого давления. Новые пептиды в сравнении сизвестным прСКР(1-40)ОН обеспечиваютлучшую активность при более длитель-.ном времени действия (до 9,3 ч против 2,2 ч) и невысокую токсичность.1 табл, 4355710 Время смешивания, мин 1. 607 ТРА/27,этандитиол 102. 607 ТРЛ/27.этацдитиол , 153, ТРА/17. этацдитиол4. ЕгзГ(107) в СНС 1 0,55. МеОН 0,56, Ез Г 1(107) в СН СО, 57, МеОН (дважды) О, 58. СН 1 С 1 г (дважды) О, 5Присоединения предпочтительно проодят в соответствии с графиком опе 1 аций В:Реактив 50 Время смешивания, миц55 9. РСС 110. ВОС-аминокислота 50-90 И:зобретение относится к способу ,получения пептидов " цозых биологически актиьзцых соединений, которые могут цайти применение в медицине,511 ель изобретения - синтез новых производных пептидов - малотоксичцых, обладающих более высокой способностью промотировать выделение гормона роста.П р и м е р 1. Синтез пептида 1 з-С 1 п 7,Г 1 е -г 1 зСКР(1-29)-ГН, К-Нгя-А 1 а-Аяр-А 1 ае-Рзе-Тзг-БегБег-Туг-Агя.1 е-Ьеи-С 1 у-С 1 п-Ьец-ТугА 1 а-Агя-Ьуя-Ьеи-Ьеи-НгяС 1 ц-Е 1 е-И 1 е Ляп-Агд-ГН проводят моностадийцо на пептидном синтезаторе "Бекман 990" с использованием 2 г смолы МВНЛ, имеющей диапазон замещения О, 1 0,5 ммоль/г смолы, Присоединение ВОС Агц(ТОБ) к смоле осуществляют используя КР в смеси 507 в метиленхлоориде при 60 С в течение 24 ч при перемешивании, при этом происходит замещение 0,35 ммоль Лгя ца 1 г , 25 смолыПосле деблокирования и нейтрализации ца смоле стадия за стадией строят пептидную цепь. Все используемыеастворители тщательно дегазируют 30 барботированием инертного газа, наример гелия или азота, чтобы гаранировать отсутствие кислорода, котоый мог бы привести к нежелательномукислению серы МеГ-остатка.35Деблокирование предпочтительнороводят в соответствии с графиком операций А:Реактив 11, Г 1 еОН (дважды) 0,512, СН С 1 (двлжды) 0,53. Лс О (31) вСН,С 1; 15,014. СНС 1 0,515, МеОН 0,516. СНС 1 (дважды) 0,5В кратком изложении, 1-2 ммольВОС-защищеццой аминокислоты в мезленхлориде используют на 1 г смоль,добавляют один эквивалент 1,0 М0 СС 1 в метиленхлориде в течение 2 чдля большинства аминокислот, за исключением ВОС-Аге(ТОБ), Вг 1-эфир использован в качестве защищающей гидроксил боковой цепи группы для Беги Туг, Амидогруппы Ляп и С 1 п защищены с помощью Хап, когда используетсяОСС-присоединение, что и предпочтено.Р-нитрофецильный эфир (ОГР) также может использоваться для активации карбоксильцого конца Ляп илц С 1 п, например ВОС-Ляп-(ОГР) может быть присоединен в течение ночи с использованием одного эквивалецта НОВг в 507.смеси ДМФА и метилецхлорида, в этомслучае ВСС не присоединяется. 2-Хлорбензилокснкарбоцил-(2 С 1-2) использован в качестве защитной группы длябоковой цепи ЬяБ. ТОБ использовандля защиты гуациднцогруппы Лгд и имидазольного азота Нзя, а карбоксильная гругпа боковой цепи С 1 п или Агрзащищена с помощью ОВ 21, Фецольнаягидроксильцая группа ТУг защищенас помощью 2,6-дихлорбензила (РСВ).В конце синтеза получают полимернуюсмолу следующего состава: ВОС/Г" МеНгя (Х) -Л 1 а-Ляр(Х ) -Л 1 а - 11 е - Р 1 зеТНг(Х ) - Бег(Х ) -Бег(Х) -Туг(Х ) -Лгя (Х ) -Лгя (Х ) -11 е-Ьец-С 1 у -С 1 п (Х)Ьеи - Туг(Х ) -А 1 а-Лги (Х ) -Ьуя (Х ) -1,ецЬеп-Нз.я(Х) - С 1 ц(Х) - 11 е-Мег-Ля 1 з(Х )Лгя (Х ) -Х ,где Х-ТОБ,Х)СВ,Хз-ОВ 21,Х-В 21,Хя-Хап, Х 6-ТОБ,ХС 1-2 и Х з представляет собой - ГН-переметилбецзгидриламин, Хап может быть частичноили полностью удален с помощью ТРАобработки, используемой для деблокирования с(-амицозащитцой группы.Для расщепления и удаления защиты5,4 г защищенной пептидосмолы обрабатывают с помощью 1,5 мл ацизола,0,5 мл метилэтилсульфида и 15 мл фтористого водорода (НР) ца 1 г пептидоо,смолы при -20 С в течение получасаои при 0 С в течение получаса. После34удаления фтористого водорода в вакууме остающийся смолопептид промывают чередованием сухого диэтиловогоэфира и .хлороформа, затем пептидэкстрагируют. 2 И дегазированной уксусной кислотой получают 2,84 г (путем Фильтрования).Расщепленный и лишенный защитыпептид после этого растворяют в 0-5%уксусной кислоты и подвергают очистке, которая может включать ультрагель-фильтрацию на "Сефадекс", получают 204,4 мг,Затем пептид очищают препаративный ЖХВД, Кассеты, устанавливаемыена препаративном жидкостном хроматографе ЬСпроизводства фирмы"Уотерс ассошиэйтс" набивают двуокисью кремния типа С -Б 11 са 1520 мкм (фирма "Вайдэк") (300 А).Градиент СНСИ в ТЕАР создают с помощью грациентного аппарата Элдекснизкого давления, хроматографическиефракции тщательно контролируют с помощью ЖХВД и собирают лишь те, длякоторых характерна существенная чистота. Высаливание очищенных фракций,независимо проверенных на чистоту,осуществляют с использованием кассет15-20 мкм Си 15-20 мкм фенил иградиента СН СН в 0,1% ТРА, Централь. ная фракция затем подвергалась лиофильной сушке, получают 89,2 мг целевого пептида, чистота которого превышает 98 .П р и м е р 2. Синтез пептидаШ,ец Б 1 е ЬрСКР(1-29)МН, Н,Туг-А 1 а-Аяр - А 1 ае-РЬе-Тйг-Аяп-БегТуг-Аг-Ьуя-Ча 1-Ьец-С 1 у-С 1 п-Ьец-БегА 1 а-Агс-Ьуя-ЬецЬец-Ндя-С 1 п-Т 1 е-Н 1 еБег.-Атя-ИН осуществляют методом последовательных стадий с использованием пептидного синтезатора "Бекман990" на смоле МВНА по примеру 1. Судя по данным ТЬС и .НРЬС, пептидполучен существенно чистым, выход165 мг Ы 3=-53,3 (С=1, уксуснаякислота),П р и м е р 3. В этих же условияхполучены пептиды: РЬец ,И 1 е.Я 7гСКЙ (1-29) ИН,1 , Н-Н 1 я-А 1 а-Аяр-А 1 аеРЬ е-ТЬ г- Б е г-Б е г-Ту г-А гя-Аг 8-11 е-ЬецС 1 у-С 1 п-Жец-Туг-А 1 а-Агд-Ьуя-Ьец 0 Ьец-Ндя-С 1 п-,11 ее-Аяп-Аг 8 МН,выход 226,7 мг, й р =-51,2 (С=1,уксусная кислота), ТЬС и НРЬС подтвердили чистоту пептида. 31574001 и 1 3 ЬРСБР( 3 - 29)ИЦ .НТуг-Л 1 в-Ляр-Л)в-Т 1 с-РЬе-ТЬг-ЛяпБег-Туг-Лгц,уя-Чв-Ьсц-С 1 у-С 1 п-ЬецБег-Л 1 а-Лгц-Ьуя,ец-Ьеп-С 1 и-ОС 1 п.еН) е-Бет -Лгг 1 Н , выход 204,4 мг,сС 7 р =- 50, 0(С=1, уксусная кислота) .1 И фМеТУ г , РС 1 пгЬСгР (1-29) БН.ЫМеТут-А 1 а - А яр-А 1 ае-РЬе-ТЬ гегБег-Туг-Агя-Агяе-Ьец-С 1 у-С 1 п-ЬецТуг-А 1 а-Агр-Ьуя,ец-Ьец-Н 1 я-РС 1 п 11 е-Ме-Аяп-АгяИН , выход 52 мг,ю сс 1, =-51,7 (С=1, уксусная кислота).Данные ТЬС и НРЬС подтвердили сущест 15 венную чистоту пептида.Для определения эффективности поФлучснных синтетических пептидов впромотировании выделения гормона роста были осуществлены испытания 1 п20 ч 11.го с использованием синтетическогоЬрСКР(1-40)-ОН в качестве стандарта.Испытывались пептиды в эквимолярныхконцентрациях. Применяемые культурывключали клетки гипофиза крысы, уда 25 ленного за 3-5 дней до эксперимента.Для сравнительных испытаний использовали культуры, которые считаются оптимальными для секреции гормонароста.ЗО Инкубирование с испытуемым веществом проводили в течение 3-4 ч, апикаоты культуральной среды отбирали ипереносили для измерения их содержимого в иммуноактивный СН(дг СН) и35проводили испытания хорошо-охарактеризованным радиоиммунным способом.Результаты этого сравнения сЬрСКР(1-40)ОН для эквимолярных концентраций представлены в таблице.Испытания 1 п ч 1 Сго этих синтетических пептидов показывают, что каждый из них проявляет полную внутреннюю биологическую активность ЬрСКР(1 - 40)-ОН.45Максимально эффективная концентрация дляОЬецз,И 1 еЬрСКР(13 2729)ИН 1 нмоль,7 дополнение к испытаниям Ы ч 1 сгоцля секреции гормона роста провели50эксперименты .п чз.чо введением синтетических пептидов через вживленныйкатетер в свободно двигающегося нор- .мально самца крысы после предваритель.ной обработки их РЬА, ингибиторадопамин гидроксилазы, который подав 55ляет спонтанную секрецию СИ без воздействия на реакцию к экзогенномуСКР. Через тот же катетер сразу же,через 5 и 20 мин после введения быпиФормула из обретения Способ получения пептидов общей формулы 1К -А 1 а-Азр-А 1 ае-Ре-ТЬг-К -9 Бег-Туг-Агя-К -К, -Ьец-С 1 у-С 1 п-К.и о з К з-А 1 а-Агя-Ьуя-Ьец-К -К -Р -11 еДЭ 2 У Ю 1 е-Кд -Ага-ИН,К -ММеТуг,Н 1 я;где К 8 Бег,Аяп.К - Агя,ЬуяК - Ьец или РЬецКч - Тугу БегКэ- Ьец или Р-ЬецКу- Н 1 я,С 1 пКу- С 1 п,РС 1 п или АзрКи- Аяп,Бег 40 5 14351 взяты образцы крови. Уровни СН в крови, измеренные радиоиммунологически, показывают, что синтетические чепти" ды, полигенные в условиях способа, являются мощными стимуляторами секре. ции гипофизной СН и, кроме того, проявляют более длительное действие. Другие известные тесты СКГ 1 п чиччо, которые являются эффективными для об" 10 наружения секреции СН, использовали для подтверждения этих результатов. Рассматривали дозы от 100 кг до 50 мкг этих пептидов на кг живого веса," которые являются эффективными в воздействии на СН секрецию.5Проведенными испытаниями установ" лено, что соединение по изобретению относится к категории малотоксичных,Таким образом, соединения, полученные в условиях данного способа, обладают более высокой активностью в отношении промотирования секреции гормона роста, чем известный промотор ЬрСКГ(1-40)ОН, кроме того, они проявляют более длительное действие. 57 6, о т л и ч а ю щ и й с я тем, чтозащищенный ВОС и ТОБ аргинин связывают с метилбензигидриламиновой смолой,защитную ВОС группу отщепляют и проводят постепенное наращивание пептидной цепи в последовательности, соответствующей формуле 1, используя1-2 ммоль защищенной аминокислоты награмм полимерной смолы, процесс ведут в диметилформамиде, метиленхлориде или их смеси и от полученнойпри этом пептидной смолы формулы 11Х-К(Х или Х)-А 1 а-Аяр(Х )-А 1 а 11 е-РЬе-Тйг(Х)-К 8(Х или Х)-Яег(Х)Тег (Х 5-Агя (Х ) -К г (Хили Х 7 ) -К-Ьец-С 1 у-С 1 п(Х) К тт К уу Х ) -А 1 аАгд(Х)-Ьуя(Х 7)-Ьец-К К (Х илиХг)-К (Х э)-11 е-М 1 е-К (Х, или Хз) -Агь(Х )-Н-,где Х - водород, ВОС;Х 1 - водород, 2,б"дихлорбензоил;Хз - водород или Овг 1;Х - водород или бензил;Х в , водород или ксантил,Х - водород или тозил;Х - водород или 2-хлорбензилоксикарбонил;Е - ВНА, МЬНА,отщепляют защитные группы и полимерную подложку, обрабатывая пептидилполимер трифторуксусной кислотойили фтористцм водородом при (-.20)- б0 С в присутствии анизола и/или ме 1 иленсульфида и целевой продукт выделяют с помощью жидкостной хроматографии высокого давления.Приоритет по признакам13. 09. 83 при К -М МеТуг , К 8-Бег,К -Агд, К з -11, К 1,ец, К, -Туг,Кд -Ьец, Кэ,-Н 1 з, К-РС 1 ц, К -АзЬ;25.10,83 при К-Н 1 з, К-Азй,К 1 Ьуя К 1 з ча 1, К, -РЬец, К.8-Яег,ец К С 1 ц К С 1 ц АзрКС 8 Бе1 И Ч 1 Г 0,2 1 П Ч 1 ЧОЧ Иснытуечые соединения 1. 11 рСКР(1-40) 100 2,2 2,И МеТуг Я 1 е гСКГ(1 - 29) ЯН 130 3. П-.ец1 Я 1 е 3 ЬрСКГ(1- 29) 11 Н138 7,2 4. 0-Ьец , М 1 е 311 рСКГ(1 гт29) ИН160 6,2 5.Р-С 1.ц 2, М 1 е 1 ЬрСКР(1- 29) ЧН 125 5,8 Составитель С.ВолковаТехред М.Моргентал Корректор А.Обручар Редактор О.Спесивых Заказ 5568/59 Тираж 348 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж-ЗЗ, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород, ул. Проектная, 4