Способ получения гемолизина

Союз СоветскнкСоцнапнстнчеснниРеспублик ОП ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ 1 ц 942763(5 )М, К.е.А 61 К 37/02 3 Ъеударстеенный комитет но делам изобретений и открытий(2) Авторы изобретения хоокеанский институт биоорганиче Дальневосточного научного центра явитель(5 Й) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕМОЛИЗИ Изобретение относится к медицине,а именно к способам получения природных физиологически активных белков ипектидов, в частности к способу полу"цения анемонотоксина, обладающего гемолитической активностью,Известен способ получения гемолизина из актинии 5 то 1 спас 11 в Ье 11 апспцз,включающий гомогенизацию цельных актиний, экстракцию в дистиллированнойводе, последующую очистку центрифуги"рованием, гельфильтрацию на сефадексеГи ионообменную хроматографию накарбоксиметилцеллюлозе 13.Однако этот способ не обеспечивает 1выхода целевого продукта достаточнойчистоты (содержится в качестве примеси три минорных белка ) и высокойудельной активности (8800 ГЕ/мг),Сырьевая база для получения гемолизи- гна ограничена.Цель изобретения - повышение удель"ной активности целевого продукта, егочистоты и расширение сырьевой базы. Поставленная цель достигается тем,цто согласно способу получения гемолизина из морских актиний, включающему их гомогенизацию, экстракциюдистиллированной водой, последующуюочистку центрифугированием и ионооб"менной хроматографией на КМ-целлюлозе, в качестве источника. сырья используют актинию Нопюзй 1 сЬапцз дцегдея 1и после центрифугирования проводят оочистку на политетрафторэтилене.П р и м е р. 1 кг актиний Нопюз 1 спапйцз дцегс 1 ето 1, свежевыловленных или хранящихся в замороженном состоянии при -13 С, гомогенизируют(1000 об/мин, 5 мин) при соотношенииткань: вода равном 1:3, экстрагируютв течение 12 ч при 1 С, затем центрифугируют при 20000 д в течение1 ч. Прозрачный раствор 1,5 л(15 мг/мл белка по Лоури) койцентрируют лиофилизацией до 0,5 и наносятна колонку (3,5 х 100 см) с политетрафторэтиленом (полихром 1), урав"формула изобретения Стадия выделения Гемолитическая активностьбелка,ГЕ/мг Выходбелкав мг/кгактиний Суммарный экстракт 20000 400 Хтоматография наполихроме 1 242 2000 102 5000 45 Ионообменная хроматография наКМ-целлюлозеРехроматография на КМцеллюлозе 50 20 12500 ВНИИПИ Заказ 4936/8 Тираж 714 Подписное филиал ППП "Патент", г, Ужгород, ул. Проектная, 4 3 94276новешенным дистиллированной водой,Элюцию осуществляют дистиллированнойводой, скорость элюции 120 мл/ц. В ре.зультате хроматографии удается избавиться от основной массы баластныхбелков. фракции, проявляющие гемолитицескую активность, объединяют и используют для хроматографии на колонке(1,5 х 30 см) с карбоксиметилцеллюлозой (КМ, Ватман, Англия); уравно вешенной 0,01 И ацетатным буферомрН 6,0. Элюцию белков осуществляютлинейным градиентом хлористого натрия от 0 до 1 И в ацетатном буферепо 0,650 л каждого. Фракции, проявляющие гемолитическую активность, объединяют и используют для рехроматографии на КМ-целлюлозе в тех же условиях,Гомогенность гемолизина, полученногопо предлагаемому способу, доказываютметодом диск"электрофореза в 104-номполиакриламидном геле в натрий додецилсульфате при рН 7,5 и М -концевого анализа, М -концевая аминокислота гемолизина - серин,г 5Полученные результаты показывают,что препарат гемолизина,полученныйпредлагаемым способом, является индивидуальным белком,Данные по выходу белка и удельнойактивности препарата на всех стадияхвыделения представлены в таблице,3 фСпособ позволяет получить препарат, очищенный от основной массы примесных высокомолекулярных белков уже на первой стадии очистки не политетрафторэтилена и высокоочищенный препарат после хроматографии и рехроматографии на карбоксиметилцеллюлозе, Использование высокоэффективного гидрофобного сорбента значительно упрощает процесс получения гемолизина, так как исключается необходимость в применении трудоемкогс и дорогостоящего процесса изоэлектрофокусирования после хроматогоафии.Сравнения активности белка, выделенного из актинии (0,00 мкг/мл) с активностью белка полученного по известному способу из актинии (0,1 мкг/мл) показало, что предлагаемый способ позволяет полуцить препарат с более высокой удельной активностью (12500 ГЕ/мл белка).Предлагаемый способ обеспечивает повышение удельной активности целевого продукта в 5 раз,уже на первой стадии очистки сокращает время. его выделения и позволяет получить продукт, являющийся индивидуальным белком, без примесей минорных белков,Способ получения гемолизина изморских актиний, включающий их гомогенизацию, экстракцию дистиллированной водой, последующую.очистку, центрифугированием и ионообменной хроматографией на КМ-целлюлозе, о т л иц а ю щ и й с я тем, что, с цельюповышения удельной активности целевого продукта, его чистоты и расширения сырьевой базы, в качестве источника сырья используют актинию Ново 5 Ссапйцз диегдев 1 и после центрифугирования проводят очистку на политетрафторэтилене,Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Ое 1 ч 1 п 1.Р. 1 зо 1 аоп апд Рагг 1 а 1 Рцг 111 са 1 оп оГ Нево 111 с ТохпГгов 5 еа Апевопе. 5 со 1 сЬаеоз г 1 е 11 апЬиз. .1, РЬа гвасеис 1 са 1 5 с 1 епсе, 63,9, 1478-1480, 1974.