Способ изготовления микоплазменного антигена для иммунологических реакций

882 ЗУ ОПИСАНИЗОБРЕТЕНИЯ Союз Советских СоциалистическихРеспублик 61) Дополнительное к авт. свид-ву22) Заявлено 03.06.74 (21) 2031271/28-15с присоединением заявки Мв23) Приоритет43) Опубликовано 15.01.78, Бюллетень М45) Дата опубликования описания 01.02.7 1) М. Кл.2 С 12 К 1/00А 61 К 39/00 Государственный комнте Совета Министров СССР(088,8) по делам изобретений и открытий(72) Авторы изобретения Боровик 3. Гаффаров и 1) Заявитель азанский ордена Ленина ветеринарный институт им. Н умана(54) СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ МИКОПЛАЗМЕННОГО АНТИГЕНА ДЛЯ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ нтиг Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к получению аптигена, предназначенного для серологической диагностики инфекций животных и человека микоплазменной этиологии.В настоящее время серологическая диагностика заболеваний человека и животных микоплазменной этиологии построена на показателях РСК, Для этой реакции в качестве антигена используют микоплаз мы, выращенные преимущественно в жидкой среде, отмытые, ресуспендированные и сконцентрированные в 10 - 40 раз 1.Помимо получения корпускулярного натив- ного концентрированного анти гена известен способ приготовления антигена путем разрушения биомассы микоплазм, например, обработкой трипсином, хлороформно-метанольной смесью 2.Однако получаемый антиген не всегда имеет достаточно высокую активность, титр его как правило не выше 1:60.Целью изобретения является разработка способа получения микоплазменного антигена, позволяющего максимально извлечь комплементсвязывающий (липопротеидного) и прецинитирующий (полисах аридного) антигены и тем самым повысить активность антигена.Поставленная цель достигается тем, что разрушение биомассы микоплазм проводят 1 о/о-ным раствором Твина, который добавля 1 от к биомассе в соотношении 1:10 в присутствии равного объема этилового эфира, смесь встряхивают в течение 10 минут, вы держивают в течение часа при +4 С и удаляют образовавшийся верхний эфирный слой.Нижний образовавшийся антигенный слой обрабатывают иммуноадсорбентом в течение 24 часов при 37 С с последующим удалением его О центрифугированием при 1000 об/мин в течение 20 мин.Приготовление микоплазменного а енасостоит в следующем.Микоплазмы выращивают на жидких пи тательных средах, приготовленных на основетриптического перевара бычьего сердца по общепринятой прописи с добавлением сыворотки лошади или на среде из кроличьего мясного бульона с добавлением сыворотки крупного О рогатого скота. Выращенную культуру микоплазм концентрируют центрифугированием при 20000 об/мин в течение 45 мин в 200 - 400 раз. Полученный осадок ресуспендируют в физиологическом растворе, рассматривают 5 как исходную биомассу для приготовления антигена. Раствор Твинаготовится в дистиллированной воде ех 1 егпроге из расчета 100 мг на 10 мл воды (1%-ный раствор). Твинявляется многоатомным спиртом - полиокси- О этиленсорбитанмонопальмннат,588237 Формула изобретения Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Биологические и химиотерапевтические45 ветеринарные препараты, М, 1963, с. 357.2. Васильева В. И. и др. Методы получениякомплементсвязывающего антигена для лабораторной диагностики М. рпецгпоп(ае - Вестник Академии м иди цинских наук СССР,50 1969, М 0 5, с. 37 - 42,Составитель И. Тареева Тсхред Н, РыбкинаКорректор Л. Орлова Редактор Н. Аристова Заказ 3173,18 Изд, Мз 109 Тираж 563 НПО Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, К, Раушская наб., д. 45Подписное Типография, пр. Сапунова, 2 Иммуноадсорбент, с помощью которого удаляли неспецифические компоненты, присутствующие в антигене, готовят по методу Лугагпеаз и ТегпупоК пппупос 1 тегпЫгу,6,53 - 56, 1969). С этой целью предварительно полученную кроличью сыворотку к нормальным компонентам питальной среды, обрабатывают глутаровым альдегидом. Кроликов можно иммунизировать по любой схеме с высокими титрами прецинитирующих антител. Затем сыворотку кроликов, иммунную по отношени 1 о к нормальным компонентам сред, превращают в иммуноадсорбент с помощью глутарового альдегида. К 4 частям сыворотки добавляют 1 часть 2,5% глутарового альдегида и оставляют на 4 часа при комнатной температуре. Образовавшийся гель тщательно измельчают и отмывают от несвязанных белков 0,2 М фосфатным буфером, имеющим рН 7,6 3 - 4 раза, затем отмывают 0,1 М НС 1 - глициновь 1 м буфером с добавлением 0,2 М ХаС 1, имеющим рН 2,8. И наконец снова повторяют процедуру отмывания 0,2 М фосфатным буфером до полного удаления белков в надосадке.Хранят иммуноадсорбент в 0,2 М фосфатном буфере с добавлением 0,02/, азида Ха с целью консервации. Биомасса микоплазм подвергается дезинтеграции смесью Твинаи эфира. К 9 частям биомассы мпкоплазм добавляют 1 часть раствора Твинаи смешива 1 от с равным объемом химически чистого этилового эфира, Обработку проводят при комнатной температуре в течение 10 мип при постоянном встряхивании. По истечении этого времени делительную воронку с обрабатываемой смесью помещают в холодильник при +4 С на 1 - 2 часа, После отстаивания смесь разделяется на два слоя: верхний - эфирный и нижний антигенсодержащий слой. Антигеп смешивают с иммуноадсорбентом в соотношении 2:1, выдерживают в течение ночи при +4 С и 1 - 2 часа в термостате при 37 С. Затем иммуноадсорбент удаляют центрифугированисм при 1000 об/мин в течение 20 мип, Полученная надосадочная жидкость служит единым комплементсвязывающим антигеном, пригодным для РСК и РДП, Антиген можно консервировать азидом натрия в конечной концентрации 0,02/ В течение 3 месяцев антиген при +4 С не снижал активность (срок исследования) . Предлагаемый способ приготовления антигенов из микоплазм имеет следующие преимущества:активность антигенов в РСК выше (1:64 - 5 1:128), чем активность корпускулярного антигена (1:30 - 1:60);микоплазменные антигены активны, как вРСК, так и в РДП. В РДП антиген выявляет большее количество прецинитирующих компо О пентов, чем антиген для РДП, приготовленныйс помощью термолизиса или ультразвуковой обработки;мико плазменные антигены, изготовляемыепо данной методике, практически свободны от 15 антикомплементпых свойств,201. Способ изготовления микоплазменногоантигена для иммунологических реакций, включа 1 ощий разрушение биомассы мико- плазм, отличающийся тем, что, с целью 25 получения антигена, пригодного одновременнодля постановки РСК и РДП в агаровом геле, разрушение биомассы микоплазм проводят 1% -ным раствором Твина, который добавляют к биомассе в соотношении 1:10 в при сутствии равного объема этилового эфира,смесь встряхивают в течение 10 минут, выдерживают в течение 1 ч при +4 С и удаляют образовавшийся верхний эфирный слой.2, Способ по п, 1, отличающийся тем, 35 что, с целью удаления из антигена неспецифических компонентов, нижний образовавшийся антигенный слой обрабатывают иммуноадсорбентом в течение 24 ч при 37 С с последующим удалением его центрифугированием при 40 1000 об/мин в течение 20 мин.