Способ получения фермента на полимерной матрице

425936 Сбюз Советских Социапистнческих Республик(32) Приоритет -Опубликовано 30,04.74,Государственный комитет Совета Министров СССР по делам изобретеиий и открытийБюллетень Ме 16 Дата опубликования описания 10.03,75. Беликов, А. К. Овчаров, Л. С. Слобо В, К. Латов и М, О, Рожанский Ленина институт элементоорганически(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТА НА ПОЛИМЕРНОЙ МАТРИЦЕют дееметилсульфоксид,амид.особ осуществляют след,с н Изобретение относится к области техничекой биохимии, а именно к способам получеия ферментов на полимерной матрице.Известен способ получения ферментов на полимерной матрице, путем смешивания сополимера и раствора фермента и выдерживания полученной смеси при перемешивании с последующей промывкой полученното осадка. Из-за нерастворимости исходных полимеров в водной среде такой способ длителен.Кроме того, частичный гидролиз полимерных реакционноспособных групп, например ангидридных, снижает эффективность процесса, при этом получаемые фермент-полимерные препараты имеют низкую ферментативную активность.Целью изобретения является сокращениевремени на реакцию связывания фермента с матрицей.Для этого сополимер и фермент перед смешиванием растворяют в апротонном диполярном растворителе, а после выдерживания в смесь вводят водный раствор кислоты.При этом из растворов кислот используютраствор соляной кислоты.Кроме того, в водный раствор соляной кислоты вводят соли поливалентных металлов, например хлорное железо.При этом из апротонных диполярных растворителей иапользу а также диметилформПредлагаемый сп ующим образом.5 Сополимер стирола и раствор ферментарастворяют в апротонном диполярном растворителе, например в диметилсульфоксиде илн диметилформамиде, а затем их смешивают.Полученную смесь выдерживают прп переме шивании, после чего в смесь вводят водныйраствор соляной кислоты и соли поливалентных металлов, например хлорное железо.Осадок отделяют цвнтрифугированием ипромывают дистиллированной водой для удаления непрореагировавших веществ, после чего его высушивают в вакууме при комнат.ной теъппературе.П р и м е р 1, К 20 мл 5%-го раствора сополимера стирола и малеинового ангидрида 20 (1 г) в,диметилсульфоксиде дооавляют 20 лл10% -го раствора Протосубтилина ГЗХ(2 г) в,диыетилсульфоксиде, тередставляющего собой ферментный препарат, полученный из культуральной жидкости Вас. зпЬт 11 Ы. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение часа и затем образовавшийся фермент-полимерный комплекс осаждают 100 лл 0,01 н. соляной, кислотой, Осадок отделяют центрифугированием и промывают дистиллированной водой, удаляя непро425936 5 1 О 15 20 25 3 О Предмет изобретения 35 4 О 45 50 55 Заказ 73/247 Изд.1569 Тираж 456 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Тип. Харьк. фил, пред. Патент реагировавшие вещества. Затем осадок высушивают в вакууме при комнатной температуре, получая 1,6 г фермент-,полимерного препарата с содержнаием белка 15%.Суммарная протеолитическая активностьполученного препарата составляет 2,8 Х 10 ед.Удельная протеолитическая активность составляет 70%.П р и м е р 2, К 20 мл 10%-го раствора сополимера стирола добавляют 20 мл 5%-гораствора Протосубтилина ГЗХ(1 г) в диметилформамиде, реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течениечаса и затем добавляют 50%-ный растворРеСз (500 мг), рН реакционной среды доводят до 4,0 добавлением 0,01 н. соляной кислоты, выдерживают 30 мин при перемешивании и образовавшийся осадок отделяют центрифугированием. Осадок тщательно промьввают дистиллированной водой и затем холодным этанолом при минус 10 С и высушиваютв вакууме при комнатной температуре.При этом получают 2,4 г фермент-полимерного препарата с 12/, содержанием белка.Суммарная протеолитическая активностьпрепарата составляет 1,2 Х 10 ед, Выход попротеолитической активности составляет 60%.П р и м е р 3. К 7 мл 5/,-ного растворасополимера этилена и малеинового ангидрида(0,7 г) в диметилсульфоксиде.Реакционную смесь перемешивают прикомнатной температуре в течение часа и затем добавляют 100 мл 0,005 н. соляной .иислоты.Смесь выдерживают 30 мин при комнатнойтемпературе. Образовавшийся осадок отделяют центрифугированием и тщательно промывают водой и холодным этанолом при минус10 С, получая 0,3 г фермент-полимерного комплекса с 30 содержанием белка. Суммарнаяпротеолитическая активность препарата составляет 0,29 Х 10 ед.Удельная протеолитическая активность полученного препарата 13000 ед/мг белка.Выход по протеолитической активности составляет 30%.П р и м е р 4. К 5 мл 2%-ного раствораПротелина (0,1 г) - ферментного препарата из культуральной жидкости з(г, дг 1 зсцз вдиметилсульфоксиде - добавляют 1 мл 10%.ного раствора сополимера стирола и малеинового анги 1 дрида (0,1 г) в диметилсульфок 1 сиде. Реакц 1 ионную смесь перемешивают прикомнатной температуре в течение часа и затем добавляют 50 мл 0,01 н. соляной кислоты,содержащей 1 мл 50/в-ното раствора ГеС 13(500 мг),Смесь выдерживают 30 мин при комнатной температуре и интенсивном перемешивании, Образовавшийся осадок фермент-полимерного комплекса отделяют центрифугированием, тщательно промывают водой и холодным этанолом и высушива 1 от в вакууме при комнатной температуре, получая 0,08 г фермент-полимерного препарата с содержанием 25% белка. Суммарная протеолитическая активность составляет 5500 ед/мг белка. Выход по протеолитической активности составляет 56 .Для коагуляции фермент-полимерного комплекса используют также серную кислоту,П ри мер 5. К 20 мл 10%-,ного раствора сополимера стирола и малеинового ангидрида в диметилсульфоксиде добавляют 20 мл 5%-ного раствора Протосубтилина ГЗХв диметилсульфоксиде.Реакционную смесь перемешивают в течение часа и образовавшийся фермент-полимер ный ксл(плекс осаждают 100 мл 0,01 н. серной кислоты. Осадок отделяют центрифугированием, промывают дистиллированной водой и холодным этанолом при минус 40 С и высушивают в вакууме при комнатной температуре, получая 2,5 г фермент-полимерного препа. рата с содержанием белка 11%.Суммарная протеолитическая активность составляет 1,1 Х 10 ед,Выход по протеолитической активности составляет 55%. 1. Способ получения фермента на полимерной маприце путем смешивания сополимера и раствора фермента и выдерживания полученной смеси при перемешивании с последующей промывкой полученного осадка, отличающийся тем, что, с целью сокращения времени на реакцию связывания фермента с матрицей, сополимер и фермент перед смешиванием растворяют в апротонном диполярном растворителе, а после выдерживания в смесь вводят водный раствор кислоты.2, Способ по п. 1, отличающийся тем, что из растворов кислот используют раствор соляной кислоты.13. Способ по пп. 1 - 2, отличающийся тем, что в водный раствор соляной кислоты вводят соли пол ивалентных металлов, например хлорное железо.4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что из апротонных диполярных растворителей используют диметилсульфоксид.5. Способ по и. 1, отличающийся тем, что из апротонных диполярных растворителей используют диметилформамид.