Иммобилизованная аденилатциклаза чумного микроба

)5 С 12 й 11/12, 9/88 БРЕТ 54) ИММОБИЛИЗОВА 1-1 НАЯ ЦИКЛАЗА ЧУМНОГО МИКРОБ ИЛАТзовани ится кп язанны я: полу клазу го связ йспом Активн о отно сохран сударственныи противочумный бухина и Б.Н.Ми.1 О.Р государственныи й противочумный ида Ф А 988, с. 2 инная промывают водой, а затем 0,01карбонатным буфером (рН 9,5).В 5 мл отдиализованного против 0,01 1 карбонатного буфера (рН 8,5) раствора аде нилатциклазы чумного микроба (0,5 мг/мл аденилатциклазы с активностью 2 нмоль/мг) вносят активированную матрицу ч) натрийохимии и сабам полязан ными обилизация оба.а окисленарозе С 1 6 В латциклазу т прототипа мента не со- ивирующих и рН суспензии доводят до 9,5 с помощью 2 М гидроокиси натрия. Реакцию продолжают в течение 24 часов, медленно вращая реакционный сосуд при 8-10 С,Для восстановления азометинов и оставшихся альдегидных групп добавляют 3 мл свежеприготовленного раствора борогидрида натрия в концентрации 1 мг/мл в том же буфере. Реакцию продолжают при медленном перемешивании втечение 1 часа в холодном помещении. Гель прол 1 ывают 0,01 М карбонатным буфером рН 8,5, затем 0,01 Мтрис-НС 1 рН 7.6. Активность связанной с матрицей аденилатциклазы определяют по методу (Точеу К.ЯВВеап,),А,М. А з 1 гпр 1 е Югесй аззау аког сус 11 с АМР 1 п р 1 азгпа апб ос 1 ег Ыо о 91 сазагпре озп 9 ап гпргочес ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕВЕДОМСТВО СССРГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИК ПАТЕНТУ 1(56) Дин П. Джонсон У. Мхроматография. 1 ч 1.: Мир,Изобретение относится кбиотехнологии, в частности к спучения матриц с ковалентнобелками.Цель изобретения - иммаденилатциклазы чумного микрЦель достигается тем, чтоной с помощью периодата сефковалентно связывают аденичумного микроба. В отличие ораствордля присоединения фердержит фосфатных ионов, инакаденилатциклазу,П р и м е р 1. 1,5 г сефарозы С 1 6 В, промытой 10-кратным объемом воды, помещают в пластиковый флакон объемом 15 - 20 мл. Добавляют 3 мл 0,07 М раствора периодата натрия и медленно перемешивают реакционную смесь в течение 45 - 60 мин при комнатной температуре, Добавляют 0,5 мл 2 М зтиленгликоля и продолжают перемешивание еще 30 минут, Гель отфильтровывают на пористом стеклянном фильтре,(57) Исполь логия относ лентно св изобретени аденилатци ковалентно с окисленно зой С 1 6 В, фермента и Активность е: биохимия и биотехноолучению матриц с ковами белкали, Сущность чают иммобилизованную чумного микроба путем ывания аденилатциклазы ощью периодата сефароость иммобилизованного шению к нативному 95,. яется в течение 6 мес.1838409 Н Н 35 где Р - остаток модифицированного периодатным окислением сефарозы С 6 В,Составитель О, ЛомовРедактор В. Трубченко Техред М. Моргентал Корректор Л, Филь Заказ 2905 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно.издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 совреОче рготеи Ыпс 3 пц сесЬпсне. Си, СЫв, Ас 1 а, 1974, ч,56, Р,221 - 224), Она составляет 2,5 ед/г. За единицу активности аденилатциклазы принимают количество наномелей цАМФ синтезированного одним мг фермента заминуту при 37 С, Количество.аденилатциклаэы, иммобилизованной на 1 г носителя равно 1,3 мг, что составляет 80 от добавленной для связывания. Иммобилиэованный фермент сохраняет 95;/, активности по отношению к нативному состоянию, Иммобилизованная аденилатциклаза полностью сохраняла свою активность в течение б месяцев (срок наблюдения).П р и м е р 2. Все операции проводят как в примере 1, но концентрация аденилатциклазы составляет 0,6 мг/мл, инкубация 12 часов, температура 22 С. Дальнейшие операции как в примере 1, Количество аденилатциклазы иммобилизованной на 1 г носителя составляет 1,7 мг, что соответствует 85 от добавленной для связывания, Активность связанной с матрицей аденилатциклазы соответствует 3,2 ед/г.П р и м е р 3. Все операции проводят как в примере 1, но аденилатциклаэу отдиа, лиэовывают против 0,01 М карбонатного буфера рН 9,5, Концентрация фермента составляет 0,5 мг/мл, время инкубации 10 часов, температура 28 С. Количество аденилатциклазы иммобилизованной на 1 г носителя составляет 1,4 мг, что составляет 82 , от добавленной для связывания. Активность связанной с матрицей аденилатциклазы составляет 2,7 ед/г.Как видно из приведенных примеров,получен ная иммобилизован ная аденилатциклаэа чумного микроба является высоко- активным и стабильным продуктом, имеющим большую биотехнологическую и биохимическую значимость, Поскольку аденилатциклаза является ферментом синтеза циклического аденозинмонофосфата - биологически активного вещества, используемого в биологии и медицине, то иммобилиэованная форма фермента можетбыть использована в биотехнологическомпроцессе по получению цАМФ, благодарялегкой извлекаемости нуклеотида из реакционной смеси и возможности многократного использования матрицы, Кроме того,связанная аденилатциклаза характеризуется стабильностью своей структуры, что обусловливает возможность ее"0 транспортировки на большие расстояниябез привлечения низкой температуры и других условий, обычно используемых для ферментов,Ковалентное связывание аденилатциклазы может сыграть свою роль в изучениимеханизма ее действия, т.к, дает возможность быстро изменять и контролироватьокружение фермента. Если учесть, что большинство белков клетки, к числу которых от 20 носится аденилатциклаза, активируютсяприсоединением или отщеплением неорганического фосфата, то, имея "иришитый" кматрице белок, последовательно вводя илиудаляя изучаемые вещества из реакционнойсистемы, можно точно. установить, какойименно ион катализирует его активность икакие энзимы клетки принимают в этом уча-,стие.Формула изобретения30 Иммобилиэованная аденилатциклазачумного микроба общей формулы 40Нй-Е - остаток молекулы аденилатциклаэыпосле восстановления борогидридом натрия,45 обладающая способностью синтезироватьциклический аденозинмонофосфат