Способ культивирования бактерий

(5 ОБ ТЕН ПАТЕНТ о Калик.198 ляются -Н, -СН 3 или ОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕЕДОМСТВО СССРОСПАТЕНТ СССР) ПИСАНИЕ(71) Хидеаки Ямада, Нитто Кагаку Кобусики КайсяР)(72) Хидеаки Ямада и Тору Нагасава 56) ЕР Ф 0188316, кл, С 12 й 9/78опублик, 1986.Е Р М 0204553, кл. С 12 И 9/78 Изобретение относится к биотехнологии и касается способа культивирования бактерий ВЬобососсцз гЬобосЬгоцз, продуцирующего нитрил - гидратазу, фермента обладающего способностью к гидратации нитрилов до образования соответствующих амидов.Цель изобретения - повышение активности нитрил-гидратазы.Сущность изобретения заключается в том, что используемый штамм Юобососсцз - гЬозосЬгоцз -1 не может продуцировать нитрил-гидратазу в культуральной среде, содержащей ионы железа, а также, что указанный штамм способен продуцировать нитрил-гидратазу в эффективном количестве только в том случае, если культуральная среда содержит ионы кобальта; и кроме того, что присутствие ионов железа в культу- ральной среде не только сводит к нулю продуцирование нитрил-гидратазы, при условии отсутствия в этой среде ионов кобальта, но и также приводит к снижению нитрил-гидратазной активности микроорга, 1838408 А(54) СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БАКТЕРИЙ(57) Использование: биотехнология касает) ся способа культивирования штамма бактерий ВЬобососсцз гЬобосЬгоцз - продуцента нитрил-гидратазы, Сущность изобретения. в культуральную среду добавляют мочевину или ее производное, используемые в качестве индуктора фермента, а также источник ионов кобальта - хлористый кобальт в концентрации от 5 до 15 мг/л. В качестве продуцента фермента используют штамм бактерий Яйобососсцз гЬобосЬгоцз -1 РЕЯМ ВР,.2 з,п.ф-лы, 3 табл. низма, если в укаэанной среде кроме ионов кобальта еще присутствуют ионы железа.Кроме этого, способ культивирования бактерий вида Юобососсцз гЬобосйгоцз, сбладающих высокой нитрил-гидратаэной активностью, в соответсгвии с настоящим изобретением, включает в себя добавление в культуральную среду, по крайней мере,одного из соединений: мочевины в производных мочевины, имеющих следующие формулы- ( )В 1 В 2 Й СОЙВЗВ 4где В 1, В 2, Яз и В 4 каждый являются -Н, -СНз или -С 2 Н 5, все заместители не являются -Н;Я 4 ВбИСООС 2 Н 5Где В 5 и Яб каждый яв-С 2 Н 5: иИ Н 2 С 5 Н 2 () и иона кобальта в целях получения клеток бактерий, обладающих нитрил-гидратазной активностью, путем культивирования бактерий ВЬобососсцз йобосйгоцз, обладающий способностью продуцировать н итрил-гидратазу.способностью продуцировать нитрил-гидратазу,Давление, по крайней мере, одного изсоединений: мочевины и производных мочевины формул -; и иона кобальта икультуральную среду во время культивирования бактерии Й 1 осососссгз грососЬгосгззначительно повйшает нитрил-гидратазнуюактивность указанной бактерии на единицукультуральной жидкости.Э 1 о повышение нитрил-гидратаэной активности на единицу культуральной среды,вероятно, ведет к увеличению концентрации клеток (т.е., выходу) и/или клеточнойактивности (т,е., количеству нитрил"гидратазы в клетках);При осуществлении настоящего изобретения добавление мочевины или ее производного особенно эффективно дляповышения клеточ 1 гой активнос 1 и,Подробное описание иэобретеггия1. Бактерии Й 1 осососсцз гтососгтоизВ настоящем изобретении используются бактерии Втосососсггз ФососМосгз, обладающие нитрил-гидратаэнойактивностью и способностью к п 1 дратациинитрилов, в частгтости, ароматических нитрилов, до получения соответствующих амидов, Конкретным гримером таких бактерийявляется штамм -1 (ГЕРМ БР)Юосососсиз г 1 ососпгоцз, описанггый в заявке на японский патент М 2317441988 ив заявке на патент США М 243986, упоминавшихся выше, Ниже приводятся подробное описание указанного штамма 1-1,взятые из цитируемых заявок на патент.1, Происхождение и депонирпсаниеШтамм - был выделен заявителями иэтгочвы в Сакис-кю, Киото, Япогия, и депонирован 18 сентября 1987 г. Институтом Ферментггых исследований, Агенствоттприкладных наук и технологии, Министерством международной торговли гг промь,шленности Лпоггии, где пн находится нахранении ггод номером допуска ГЕРМ ВР 1478 в соответствии с Будзпештским договором.2. Бактериологические характеристики(2) Полиморфизм: удлиненные клетки,имеющие форму палочек, в начальной стадии культивации растут до образованияпрямых палочек с изломом. а затем делятся,образуя короткую бациллярную форму35 но культуральнэя средэ с 1 гзтесгзец; положи тельно40 (9) Использование неорганических исгочг:,иков азота;нитрат: положительносоль аммония: положительно( 2) О кси да за; отри ца тел ь но(22) Термостойкость (в 10 оь сепарированном молоке при 72 С в течение 15 мин)отсутствует(з) Культуральные характеристики различных культуральных сред ЗООС5 (1) Бульонная культура на чашках Петрис агаром; круг с диаметром 1 мм (48 часов),неправильный, довольно сухой на поверхности, плоский, непрозрачный, и бледнооранжево-розового цвета.10 (2) Бульонная культура на скошенномагаре: волокно с гладкой поверхностью ислегка выпуклой, довольно сухое в поперечном сечении и бледно-оранжево-розовогоцвета,(3) Бульонная культура в жидкой среде:обильный рост с образованием мембраны.Культуральная жидкосл ь становится довольно мутггой и образуется прецггпитат в результате роста клеток20 (4) Бульог гная культура на . столбикахжолатины; хороший рост на поверхности ввиде воронки вдоль поверхности столбика,но на нижней поверхности рост ограничег.Желатин не раэжижен,25 (5) Лакмусовое молоко: беэ изменений.(8) испольэова ив лимо ной кислоты:культуральная среда Косич: отрицатель 1838408и газа из саГаз 10 20 25 30 40 45 50 55(25) Анализ жирных кислот и клеточной стенки: клетка содержит ненасыщенные и насыщенные с прямой цепью, ТСХ миколовой кислоты дает хроматограмму с единичным Гятном.Согласно оценке вышеперечисленных бактериологических свойств в соответствии с Руководством по систематической бактериологии Берги (1986), штамм 1-1 является аэробной, Грамположительной, обладающей слабой устойчивостью к кислотам, ката- лазо-положительной и не образующей эндоспор палочкой без жгутиков. Этот штамм имеет форму продолговатой палочки и мицелий в начальной стадии роста, растет с ветслением, а затем делится с образованием коротких палочек, В соответствии с указанными признаками, штамм 1-1 подпадает под тип бактерии Касагича.Анализ на состав жирных кислот обнаружил, что бактерия содержит ненасыщенные и насыценные жирные кислоты с прямой цепью, включаощих туберкулостеариновую кислоту. Поскольку ТСХ миколовой кислоты дает единичное пятно, имеющее такое ке значение Р 1 как и стандартная бактерия Я 11 одососсцз г 1 одос 11 гоцз (РО 3338), эта бактерия не является бактерией рода Мусо Ьас 1 ег 1 цт. Эта бактерия также отличается от бактерии Иосогйа по составу(числу атомовуглерода) миколовой кислоты,В результате исследования других биохимических свойств указанная бактерия была идентифицирована как Кбодососсцз гросос 11 гоцз.1. Мочевина и ее производныеВ соответствии с настоящим изобретением, мочевина и производные мочевины, имеющие формулы (1) - (111), как было указано выше, выполняют функции индукторов фер 15. ментов, Может показаться совершенно неожиданным, если учесть тот факт, что до настоящего времени типичными индукторами ферментов считались нитрилы или амиды, например, кротонамид, что мочевина и ее производные могут эффективно индуцировать нитрил-гидратазу, При этом было обнаружено, что мочевина и ее производные если и использовать не в комбинации с другими индукторал 1 и ферл 1 ентов, а отдельно, показывают значительно более высокую эффективность, чем стандартные индукторы ферментов. Кроме того, мочевина является менее дорогостоящим продуктом по сравнеио с другими индукторами, но с экономической точки зрения способ настоящего изобретения может быть с успехом применен в промышленности.Примерами соединений формулы (1), используемых в настоящем изобретении могут служить метилмочевина, этилмочевина, 1,1-диметилмочевина и 1,3-диметилмочевина,Примерами соединений формулы (11) являются уретан и метилуретан Примером соединения формулыявляется тиомочевина,Мочевина или ее производные добавляются в культуральную среду в один прием, разом, или последовательно. Термин "последовательно" в данном случае означает "непрерывно" и "с возрастанием".( 1) Ион кобальтаНитрил-гидратаза не может быть получена просто добавлением мочевины или ее производных в культуральную среду, и добавление в культуральную среду иона кобальта является вахиным фактором настоящего изобретения. (Присутствие иона кобальта является важным для полу:ения нитрил-гидратазы при помощи бактерий, как было предложено в упоминавшихся ранее патентных заявках М 23.1744/1086,Япония и М 238986, СЩА). Обычно, ион кобальта образуется при добавлении водорастворимого соединениякобальта в водную культуральную среду, Водорастворимые соединения кобальта описаны в хИмических энциклопедиях, ипоэтому специалист может легко выбратьдля использования одно из наиболее подходящих соединений.Типичными примерами кобальтовых соединений явллютсл соединения, которыеН.Н.дают Со или Со , особенно, Со , такиекак хлорид кобальта, сульфат кобальта, ацетат кобальта, бромид кобальта и бора кобальта,Кроме того, в качестве источника кобальта могут быть использованы витамин812 и металлический кобальт. Витамин В 12содержит кобальт в виде комплекса, который может быть ионизован при помощи об;работки в автоклаве, а металлическийкобальт может быть ионизован посредством ионизирующей функции микроорганизмов во время культивации,(1 Ч), Культивирование/получение нитрид-гидратазыБактерия Й 1 ог 1 ососсцэ гйос 1 осЬгоцэ всоответствии с настолщим .изобретениемможет культивироваться при любых условиях, соответствующих целям настоящего изобретения, за исключением того, что вкультуральную среду добавляются мочевина или ее производные и ион кобальта,Например, заранее определенные количества мочевины или ее производного иионы кобальта добавляют в основную питательную среду (описание основных средсм.ниже) и культивируют при температуреоколо 15 - 50 С, предпочтительно, около 2045 С, а более предпочтительно, около 30 С,при рН от 7 до 9, в течение 30 часов илиболее, предпочтительно, в течение 40 часовили более (до, например, 120 часов).Общая концентрация мочевины или еепроизводных в культуральной среде составляет около 1-30 г/л, предпочтительно, около 2 - 20 г/л, а более предпочтительно, около5-15 г/л, тогда как концентрация ионов кобальта составллет около 5-15 мг/л (расчетпроводился исхОдя из СОС 12),Основная питательная среда:Культуральная среда АКомпонент Количество(в 1 л среды)К 2 Н Р 04 13,4 гКН 2 РОа 6,5 гМа С 1,0 гмц 50 а 7 н 20 0,2 гВитаминная смесь 0,1 млДистиллированная остальное кол-восмесь (рн 7,0)Состав (в 1 л раствора):Биотин 2,0 мкгОПантотенат кальцияИнозитНикотиновая кислотаГидрохлорид тиамина5 ПиридоксингидрохлориДр-Аминобензойнаякислота 0,2 мгРибофлавин 0,2 мг 10 Фолиевая кислота 0,01 мгДистиллированнаявода остальное кол-воКультуральная среда ВК 2 НРОа 0,5 г 15 КН 2 РОа 0,5 гМЦ 50 а 7 Н 20 0,5 гДрожжевой экстракт 3,0 гДистиллированная остальное кол-вовода (рн 7,2) 20 Культуральная среда СГлюкоза 10 гК 2 НРОа .05 гКН 2 РОа 0,5 гМцЯОа 7 Н 20 .,0,5 г 25 Дрожжевой экстракт 1,0 гПептон 7,5 гДистиллирован нал остальноевода кол-во (рН 7,2)Ч. Экспериментальные примеры 30 Изменение и определение феоментнойактивности 0,4 мг(1) Метод измерения нитрил-гидратазной активностиНитрил-гидратазную акт.1 вность определяли следующим образом.2 мл реакционного раствора, содержащего 1,0 мл бензонитрила (20 мм), 1,0 мл 3-цианопиридина(1 М) или 1,0 мл акрилнит рила (1 М) в качестве субстрата; 0,5 мл калий-фосфатного буфера (0,1 М, рН 7.0), и заранее определенное количество бактериал ьных клеток (выделен ных из кул ьтурал ьной жидкости), подвергали реагированию при 20 С в течение заранее определенного периода времени, а затем завершали реакцию добавлением 0,2 мл 1 н НС 1,(2) Определение нитрил-гидратазнойактивностиНиже приводится активность, определенная в случае специфической активности С,А. и в случае общей активности О.А.;С.А, мкМ амид/мг-клетки/минО.А. мкМ амид/мл-культуральная сре да/минП р и м е р 1, Заранее определенноеколичество мочевины добавляли в описанную выше основную среду С, содержащую 10 мг/л СоС 12. К каждым 60 мл полученной культуральной среды добавляли 4 мм прекультуральной жидкости, содержащей Я 11 ос 1 ососсцз г 1 гос/ос 1 гоцз, штамм(ЕЕРМ ВР) полученной с использованием основной среды С, и культивировали. при этом встряхивая, при 28 ОС в течение 96 часов,В целях сравнения, аналогичное культивирование проводили в среде, содержа,щей либо мочеоину, либо СоС 2 в ОТДОЛЪНОСТИ,Полученные результаты систематизированы в таблице 1.Результаты, приведенные в таблице 1, показывают, что добавление моцевины в сочетании с СОС 12 явпяетсл крайне .ва:кным для 1 величания продуцированил нитрилгидрэтазы.П р и и е р 2, Шталм 1-1 подвергали культивипоеанию в соответствии с Описанием в Примере 1, при 28 С. и течение л 8-1 О часОв в Основной среде С, в присутствии 10 мг/п СОС, длбавллл ипи не добавллл заранЕе Определенное количество индуторов фЕРЬгоптое (ГлОЧЕВИНУ Л КоотОНВМНД). КЗК ПО- казано в табличкеЗначения С А. и С 1,А., приведенные в таблице 2, были пплуценгл при максимальных значениях С,А, во время измерений активности,гак видно из табпи 1 ьь испопь":Оеание в качестве индуктора фермента лишь Одной мочевины без к 1 гогонв гида приводит значительному увепиценикг г( дуцировэнил нитрип-гидрэтаэььП р и м е р 3. Заранее Определенное количество производик моцевлнь. добавляли в ОсноенуО среду С, содекэщую 10 мг/л СОС 12. . кахдым 60 клл полученной культу 1)альной среды до Являли 4 Г;л прекультуоэльной жи Тостгг, соде 1 гх:а 1 цей Я 11 осОсоссоз г 1 ес 1 ос 1 гопз, штамм 1-1 (ГЕРМ ВР) полученной с использованием основной среды С, и куль п вировал.л. встряхивал, при 28; в течение 96 чзсов.В цеплх сравнения, аналогичное культивирование проеодипи в среде, содергкащей либо метилмочевину, пиба СОС 2 по Отдельности.Результаты приведены в таблице 3, в которой значения С.А. и О.А. были получень при максимальных значениях С.А, во времяизмерения активности, В этой таблице добавлены для контроля результаты, полученные для 7,5 г/л мочевины,Результаты, приведенные в таблице, показываот, что добавление производного мочевины и СОС 2 ведет к значительному повышениюпродуцирования нитрил-гидратазы,Формула изобретения10 1. Способ культивировайия бактерийштамма ВЬО;1 ососсцз ггобос 1 гопз, продуцируюьцего нитрип-гидрвтазу на питательнойсреде в присутствии индуктора ферментапри оптимзл 1 них условиях биосинтеза, о тл и ч а ю ш и й с л тем, что, с целью повыше"ния активности нитрил-гидра 1 азь, в качест.ве штамма используют ЯПОНООсоссозг 11 ойОсбги 3 1-1 ЕЯЬЛ ВР М 1478, з е исходную питательную среду доггопнитепьно оно.20 слт источник ионов кобаль)а иИСПОЛЬЗУОлЬЕ В Ка Естло ИНДУКТОРа фЕРмел га мочевину или производное мочевиныформулы(1) л г 13Я Я,гМСО.1 Я"Ядгде Яг, Я 2, Яз и Я кзгкдый явллптсл -11-СНзили гн., зв исключением того, то зсе заместители не ллплют;я -1-1,Я;,Я;И СООСТЕР г 11)где Яз и Яб кагкдьлл явллетсл -Н; СРз или С;.1-;,;30 Ы Н, СЯ 1-2,11)2. СПОСОб ПГ П 1, О т Л И Ч 3 го Щ И й С лтем, по кпщентрацио мочевин или еепроизводных в питательной сред устанав 35 ливают От 1 до 30 гамп.3, Способ пп п,1, о т и л -. з го щ и й с ятем, что источщком ионов ксбальгв яплястся хперистый кобальт в концентрации От 5до 15 мгп.40 Приоритет по и ризпакэм;06.10.88 - признаки пунктов 1, 2, 3. раскрыегнощие использование культугвльнойсреды, содержащей Одновремеи а ионы кобальта и мочееину.15 28,0,89 - признзки пунктов 1, 2, 3, )Вскрывак)шие использование супглуральной среды,содержащей одновременно ион кобальта ипроизводные моцееины формул 1, 2, 3,1838408 12 Продолжение табл.1 блица 2 лица Реда кт роцзводственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул,Гагарина, 101 Заказ 290 ВНИИСоставитель И. ПриваловаТехред М. Моргенал Корректор.Т, Вашк Тираж ПодписноеГосударственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СС 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5