Способ определения сахаролитической активности микробов

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 549 119) 111) 5154 С 12 Ч 1/00 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯН АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ(57) Изобретениемикробиологии и пр ЛЕНИЧ САХАРОЛИТИМИКРОБОВтносится к областиедназначено для быс ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРО.ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(71) Кишиневский государственныймедицинский институт(56) Авторское свидетельство СССУ 548623, кл. С 12 Я 1/00, 1977.Авторское свидетельство СССРР 707963, кл. С 12 Я 1/04, 1980. рого определения сахаролитическойактивности микробов при их идентификации. Для повышения чувствительности способа на поверхности бумажного диска с гидрофобным покрытиемразмещают углеводные субстраты и ин"дикатор в виде фиксированных энзимоиндикаторных микропленок, содержащихдополнительно гидролизат казеина сухой и желатин при следующем соотношении компонентов, мас.Х: субстратуглеводный 2-3; гидролизат казеинасухой 0,9-1,5; желатин 0,9-1,5; феноловый красный 0,01-0,025; фосфатныйбуферный раствор рН 8,0 остальное.3 табл.Изобретение относится к микробиологии и предназначено для определениясахаролитических свойств микробов,Целью изобретения является повыше 5ние чувствительности способа,Способ заключается в том, что наповерхность бумажного диска с полимерным покрытием размещают углеводные субстраты и индикатор в виде энзимоиндикаторных микропленок, которые дополнительно содержат гидролизатказеина сухой, а в качестве Фиксирующего вещества - желатин при следующем соотношении компонентов, мас. :углеводный субстрат 2-3; гидролизатказеина сухой 0,9-1,5; желатин 0,91,5; феноловый красный 0,01-0,025;фосфатный буферный раствор РН 8,0остальное. 20Включенный в состав микропленкиуглеводный субстрат используют в качестве ферментируемого субстрата, Феноловый красный играет роль индикато"Ра РН реакции, осуществляемой сахаролитическими Ферментами микробов прииспользовании ими углеводных субстратов. Желатин фиксирует на поверхности бумажного диска с полимернойпленкой субстраты и индикатор и вместе с гидролиэатом казеина одновреиенно служат питательными веществами,за счет которых происходят рост, размножение микроорганизмов, сахаролитических ферментов и их определения.Это позволяет повысить чувствительность и ускорить определение, чтоприводит к быстрому накоплению сахаролитической активности микроорганизмов до 7 ч при концентрациях от1 млрд.-1 млн. и до 18-24 ч при концентрациях до 10 микробных клетокв 1 мл.Чувствительность и скорость определения сахаролитической активностимикробов в предлагаемом и известномспособах приведены в табл. 1.Способ осуществляют следующим образом.К навескам углеводородного субстрата и гидролизат казеина сухой приливают растворы желатина, Феноловогокрасного и фосфатного буферного рН8,0, затем растворяют смесь на водяной бане при 90 С и получают субстрйтно-индикаторно-фиксирующий раст 55вор. Полученный и охлажденный до комнатной температуры раствор наносятна поверхность диска с полимерным покрытием в виде капель объемом 0,02 мл, которые высушивают до получения фиксированных энзимоиндикаторных микро- пленок. Для определения сахаролитической активности микробов на энзимоиндикаторные микропленки наносят по 1 капле исследуемой микробной культуры и термостатируют при 37 С.П р и м е р 1. Из бумаги .с полимерным покрытием вырезают диск диаметром чашки Петри и расчерчивают 20 квадратных зон площадью 1,5 х х 1,5 см.В пробирку берут навеску соответствующего углеводного субстрата (0,25 г) и гидролизат казеина сухой (0,1 г) и к ним приливают растворы 10 -ного желатина 1,0 мл, 25 -ного фенолового красного 1,0 мл, фосфатного буферного рН 8,0-7,7 мл и растворяют смесь на водяной бане при 90 С, получая субстратно-индикаторно-Фиксирующий раствор, который охлаждают до комнатной температуры, Затем в центр каждой квадратной зоны диска наносят пипеткой по 1 капле объемом 0,02 мл субстратно-индикаторно-фиксирующего раствора соответственно обозначению углеводного субстрата и оставляют при комнатной температуре до полного высыхания. капель и получения фиксированных энзимоиндикаторных микропленок.Готовый диск с фиксированными микропленками хранят при комнатной температуре в бумажных пакетах в течение 3 лет (срок наблюдения), По мере надобности их используют для определе-.ф.:;. ния сахаролитической активноу 1 и мик робов. С этой целью в крышку чашки Петри кладут готовый диск и на энзимоиндикаторные микропленки наносят пипеткой по 1 капле микробной взве-. си, содержащей от 1 млрд, до 10 микробных клеток в 1 мл, Чашку закрываоют и инкубируют при 37 С.При расщеплении субстрата микробной культурой окраска капли переходит из красного цвета в желтый. Способ определения сахаролитической активности микробов осуществляют использованием энзимоиндикаторных микропленок, приготовленных из ин" гредиентов в пределах указанных граничных значений.П р и м е р ы 2-9. Опыты проводят аналогично примеру 1.От 0,9 до 1,5 От 0,9 до 1,5 микроорганизмов,Таблица Скорость ферментации углеводных субстратов, ч, по способу Коггцентрация+ + + р м е гг а н и е: "+"- полоянтельная реакция, "-" - отрицательная реакция з 144Зависимость чувствительности способа от количественных соотношений компонентов энзимоиндикаторных микропленок показана в табл, 2.Предлагаемый способ является более чувствительны, так как позволяет определить сахаролитическую активность микробов при концентрациях до 10 микробных клеток в 1 мл (табл,1), Это дает возможность изучить сахаролитическую активность микробной колонии, исключив этап накопления при выделении чистой культуры.Сахаролитическая активность различных микробов показана в табл.З,Кроме того, способ позволяет конструировать целенаправленные микротекстсистемы определения сахаролитической активности различны;: групп Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я Способ определения сахаролитической активности микробов, предусмат 25494ривающий размещение исследуемого образца на бумажном диске с полимернойпленкой, приготовленной с использованием углеводных субстратов, индикатора - фенолового красного, фиксирующего вещества, растворенных в фосфатном буфере рН 8,0, с последующейоценкой результатов, о т л и ч а ю -щ и й с я тем, что, с целью повышениячувствительности способа, дляприготовления полимерной пленки дополнительно вводят гидролизат казеинасухой, а в качестве фиксирующего вещества используют желатин при следующем соотношении компонентов,мас.%;Углеводный субстрат От 2,0 до 3,0Гидролизат ка 2 О зеина сухОЙЖелатинФеноловыйкрасный От 0,01 до 0,025фосфатный буферный расторрН 8,0 Остальное1442549 Таблица 2 Компоненты энэимоиилнкаторноя микропленки и их соотноие Пример бстрат каэе сухой(светло желтыйотрицател а блица леводный субстрат вид микро Глюкоза Лактоза Мальтоза Сахароза Маннит сЬег 3.сИа со 13. 055 Це 11 а соппе 3. 1669+телье Вевый елъноств способа приалиях микробов вая (иелтый цвет) - пололи