Способ получения альфа-амилазы
Похожие патенты | МПК / Метки | Текст | Заявка | Код ссылки
Текст
" "ФЕИЯЕ 8 о ИС И Е ИЗОБР АТЕНТУ 244760 1 Инк (0 Я)льсон, Пирр Эмил Корон, Дигнефф, Раулалан (ВЕ)5 Н 0 52-76480,лик, 1975. н: хорошии рост, коине и более расплывдола: отрицательная водорода: отрица морфолом), подвиж ры терминал питатель ГОСУПАРСТВЕЯЮЕ ПАТЕНТНОЕВЕДОМСТВО СССР(71) СПС Интернэшнл (72) Чарльз Энтойн Ко нелис, Колетт Сим Г.П.Валон, Коррине В (56) Патент, Японии М кл, С 12 й 15/00, опуб Изобретение относится к области технической генетики, а именно к способу получения альфа-амилазы.Целью изобретения является повышение эффективности способа получения альфа-а мил азы.П р и м е,р 1, Клонирование гена альфаамилазы,Применяют следующие материалы: ограничивающая эндонулеаэа Нпб; лигаза ДНК Т 4; фаг/лямбда ИМ 590. ДН К фага получают экстракцией фенолом иэ высокочистьх частиц фага; плазмида рВВ 322, ДНК плазмиды очищают из клеток Е.со, лизированных лизоцимом, в хлорид цезия-бромид этидия градиентах плотности; микроорганизм-хозяин: Е.со; микроорганизм-донор штамм Васоэ ве 9 атегогп со следующими микробиологическими признаками: ия; палочки (0,5 - 0,7 х 2,0 - 5,0ые, грамположительные, споные и субтерминальные;ый бульон: хороший рост;(54)(57) СПССОБ ПОЛУ 1АМИЛАЗЫ путем культивиро виях продуцирования ал микроорганизма-продуцента и й с я тем, что, с целью повь тивности способа, в качестве м ма-продуцентамикроорганизмы, выбранны штаммов: Е,со С 7001 (рСР 570, Е.со С 7002 (рСН 2) М Е,со О 7003 (лямбда альфа 11586, В.эоЬс О 8001 (р 11629.)вания в услофа-амилазы отличающ шения эффекикрооранизСпользуюг е из группы 1) ИСВ йг 1ОВ й 1 573 Ап 1 у) ИС Л йг СН 1) ИСВ + питательный бульолонии плотные посредчатые вокруг;молоко: пептониэация без изменения желатин; не сжижавосстановление н ьная реакция;каталаэная реакция; отрицательная; оксидазная реакция: отрицательная; цитоэромоксидазная реакция: отрицательная;продуцирование инобразование серотельная;потребление углеводов: потребляет арабинозу, ксилозу, галактозу, глюкозу, левулезу, мальтозу, рафинозу, сахарозу. крахмал и кислоты, полученные из них, нарамноэу, маннозу, мелибиозу, инулин и салицин не потребляет;потребление многоатомных спиртов: потребляетсорбитол иманнитол, не погребляет аденитол, дульцитол и ионозитол;(р СР 1). декарбоксилазная реакция на лизин: отрицательная;уреолиз; слабый;сопротивляемость действию тяжелых металлов: растет непосредственно на 500 м,д. Сбульон хлорид натрия; рост при концентрации хлорида натрия 3,5 ф 6;оптимальная температура роста: 30 - 37 С;максимальная температура роста: 40 - 50 С;минимальная температура роста: 5- 20"С;потребность в кислороде: аэробный микроорганизм,Микроорганизм сдан на хранение в Национальную коллекцию промышленных бактерий 12 февраля 1980 г под номером КСВ М 11568.Ниже приводится описание применения способа его получения.А, Рекомбинация и ч 1 го между ДНК лямбда и В.гпеца 1 егйаОколо 7 мкг ДЕК В.веца 1 егцв расщепляют 10 ед. Нпд при температуре 37 С в течение 1 ч в объеме 25 мкл буферного раствора Трис при рН=7,5. Около 2 мкг лямбда М 590 расщепляют аналогичным образом тем же ферментом, Реакции останавливают путем нагрева в течение 10 мин при температуре 75 С,С целью определения эффективности расщепления образцы обеих реакционных смесей подвергают электрофорезу в геле агарозы в течение 20 ч при напряжении 20 В, После окрашивания геля этидийбромидом должны получить две полосы ДНК лямбда, полученные в результатерасщепления отдельного участка Нпд на ДНК лямбда, и очень большое количество почти переКрещивающихся полос бактериальной ДНК, расщепленной на большое количество участков.Расщепление ДНК смешивают и инкубируютв течение 5 ч при температуре 10 С 0,15 единиц ДНК лигазы Т 4, чтобы могли. происходить произвольная повторная ренатурация и ковалентное окружение фрагментов ДНК.По окончании инкубации ДН К смешивают с препаратом, инкапсидированным п чего, состоящим из смеси двух комплементарно-дефективных лизатов фага (лямбда Оап и лямбда Ващ), индуцированных из не- подавляющих штаммов.Для оценки эффективности этого способа выполняют два контрольных опыта.1. Образец смеси был введен в Е,со, В результате должно быть получено 3105Ф 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 пятен на 1 мкг введенной ДНК лямбда, что указывает на большую эффективность обработки лигазой.2. Полученные таким образом пятна были исследованы визуально. Если из них 70;4 были прозрачные, а не мутные, то это указывает на присутствие фрагмента ДНК. В.те 9 а 1 егоа, который стыкует и, следовательно, инактивирует лямбда ген С, отвечающий за помутнение пятна.В. Отделение деривата фага лямбда, несущего В,вецатетег иа амилазу,Остаток инкапсидационной смеси применяют для заражения Е.со в количестве приблизительно 10 жизнеспособных час-.зтиц на посев. После роста зараженных Е,со и образования пятен посевы сортируют на присутствие пятен разложения крахмала. Это делают путем кратковременного действия на посевы парами иода, При этом пятно, образованное таким фагом, будет окружено прозрачной зоной, образующейся в результате диффузии и действия амилазы из лизованных клеток. Фаг, содержащий это пятно, немедленно отбираютдля субкультивирования (длительное действие паров иода убило бы фаг), Потомство этого пятна размножилось в чистоте (продуцируя амилазу) и обозначено как лямбда ММ 590 Апу. Фаглямбда ММ 590 Агпу сдан на хранение в Национальную коллекцию промышленных бактерий 12 февраля 1980 г, под номером МС В ч.11569.С,.Повторное клонирование гена амилазы в плазмиду рВВ 322.1 мкг ДНК из лямбда КМ 590 Агпу и 0,3 мкг плазмиды РВВ 322 расщепляют, смешивают и обрабатывают лигазой, как описано в части А. Этот препарат, применяют для трансформации по обычной методике) штамма НВ 101. Отбор производят по сопротивляемости ампициллину (ар) - свойству, которое сообщается клеткам в присутствии этой плазмиды. Обычно эта плазмида сообщает также сопротивляемость к тетрациклину (ТС). Однако введение посторонней ДНК в эту плазмиду расщепляют те 1 ген, таким образом, содержание чувствительных к тетрациклину трансформированных клонов отражает содержание содержащих плазмиды клонированных ДНК; В данном случае 16 клонов содержали новую плазмиду, которая придавала амилазе активность к Е,со. В соответствии с одновременной международной номенклатурой плазмид новые плазмиды, описываемые в настоящем описании, называются (рСР), а конкретная плазмида согласно настоящему примеру обозначенаЭто показывает, что повторное клонирование гена тем же самым ферментом (в данном случае Нпб) является очень эффективным. способом (16 вместо 1:10),Плазмидосодержащий микроорганизм обозначен Е.со С 7001 (рСР 1) и сдан на хранение в Национальную коллекцию промышленных бактерий (ИСВ) 12 февраля 1980 г. как ИСВ М 11570.Амплификация и продуцирование фермента,Продуцирование фермента в содержащих плазмиду (рСР 1) клетках улучшают двумя следующими способами.1. Насыщенные культуры.Культуры инкубируют в течение ночи при температуре 37 С на вращающемся вибраторе в пятилитровых колбах Эрлен- мейера, содержащих 1 л культуральной среды ( В; дрожжевой зкстракт-триптон),2, Хлорамфеникольная амплификация.Культуры инкубируют при температуре 37 С на вращающемся вибраторе в пятилитровых колбах Эрленмейера, содержащих 1 л культуральной среды ( В), до достижения плотности 0,8 (650 нм), после чего добавляют 150 мкг/мл хлорамфеникола. Это предотвращает дальнейшую репликацию хромосомной ДНК, но не репликацию содержащей ген амилазы плазмиды (рСР 1). После амплификации (до 3000 копий) плаэмиды по сравнению с хромосомной ДНК хлорамфеникол был удален, чтобымог продолжаться синтез протеина, а именно, после амплификации клетки отделяют от среды методом центрифугирования, промывают для удаления хлорамфеникола и повторно культивируют для продуцирования амилазы.О. выделение фермента,Клетки культивируют в течение ночи, после чего их суспендируют в 25 -ном растворе сахарозы в 0,5 объема культуры и подвергают вибрации в течение 10 мин при температуре 24 С, в результате такой обработки происходит плазмолиз клеток. Затем добавляют ЭДТК к 1 мМ конечного раствора (чтобы стенки клеток стали проницаемыми) и материал подвергают вибрации в течение еще 10 мин при температуре 24 С, Суспензию центрифугируют и клетки быстро повторно суспендируют в холодной (приблизительно 0 С) воде и подвергают вибрации при этой же температуре еще 10 мин. Суспензию снова центрифугируют и из всплывшего слоя выделяют фермент.Для сравнения культивируют микроорганизм-донор (Васоэ ведатегцв) и определяют ферментативную активность, Количество фермента на 1 мл культуральной среды определяют по методу ДНС, причемодну ферментную единицу определяют какколичество фермента, продуцирующее 1 мгвосстановленного сахара (с применением5 мальтоэы в качестве эталона для сравнения)в 1 мин в течение 10 мин инкубационноговремени. Субстрат был очень чистой амилазой,Микроорганизм-донор продуцировал10 66,0 ферментных единиц на литр культуры.Насыщенные культуры Е.со С 7001 (рСР 1)продуцировали 116,6 един иц/л кул ьтуры,тогда как после культивирования (амплификации) в течение 5 ч с хлорамфениколом и с15 последующим культивированием в течение15 ч без хлорамфеникола бактерии Е,со С7001 (рСР 1) продуцировали 84,5 единиц/л.Это показывает, что метод насыщенныхкультур обеспечивает достаточное повыше 20 ние продуцирования фермента.Фермент, продуцированный бактериями Е.со С 7001 (рСР 1), идентифицированный как альфа-амилаза, имеет следующиесвойства. Он расщепляет и амилазу и ами 25 лопектин на глюкозу, мальтоэу и мальтотриозу, главным образом мальтозу, и онрасщепляет циклодекстрин и мальтотриозуна глюкозу и мальтозу. Он расщепляет пуллулан на паноэу и/или изо-панозу.30 П.р и м е р 2. Клонирование теплостойкого гена альфа-амилазы,Микроорганизмом-донором был исходный штамм Васцз, выделенный из компоста и идентифицированный как Васцэ35 соадоапэ, Он продуцирует теплостойкуюальфа-амилазу и отличается следующимимикробиологическими признаками:морфология: палочки (0,6 - 1 х 2,5-5,0мкм), подвижные, грамположительные и40 грамотрицательные, споры центральныеили терминальные, не деформированные;питательный бульн: хороший рост;питательный скошенный агар: хорошийрост, нитевидные, раскидистые, кремово 45 белые;потребление органических кислот; лимонной - положительная реакция, малоновой - отрицательная;желатин: ожижение;50 продуцирование ацетилметилкарбинола (ацетаина): положительная;гидролиэ о-нитрофенилагалактозида;положительная;восстановление нитратов: положитель 55 ная, может получать газ;каталаэная реакция: положительная,продуцирование индола: отрицательная;декарбоксилазная реакция: на лиэин -отрицательная орнитин - отрицательная,аргинин - отрицательная;образование сероводорода. отрицательная;потребление углеводородов: потребляет;пуллуман потребляет на минимальной среде;потребление многоатомных спиртов; потребляет глицерин, сорбитол, ланнитол, инозитол, не потребляет адонитол, дульцитол;уреолиз: отрицательная;потребление лецитина: отрицательная; оптимальная температура роста: 50 С; максимальная температура роста: 55 - минимальная температура роста, 15 - 25 С;потребность о кислороде: аэробный и анаэробный,Штамм сдан на хранение о ЙС 1 В 12 февраля 1980 г как ИС 1 В ч. 11571.ДНК экстрагировали и подвергали действию Е,соИ В 1; Н 1 пс 111; РЯО; ЯаИ; ВагпН 1 и В 911. Только Вд 1 и мог.произвести много фрагментоо в широком диапазоне молекулярных весов. Однако, можно было получить фрагменты с Е,со 1 В при концентрации хлорида натрия менее 50 мМ, Поэтому применяют Е.соИ Вдля получения фрагментоо для клонирования о Е.соИ В 1 переносчика лямбда ДНК (лямбда ММ 781).А, Ограничение ДНК В.соадиапэ и ДНК лямбда КМ 781,1,25 г ДНК лямбда МЫ 781 разрезают одной единицей Е,соИ В о 25 мкл следующего буферного раствора: 10 мМ Трис-НС (рН=7,5), 1 Ь мЫ 2-серкаптоэтанола. 10 мМ сульфата магния и 100 мМ хлорида натрия, 1 мкг ДНК В,соадцапэ разрезают,тем же ферментом о аналогичном буферном растворе за тем исключением, что концентрацию хлорида натрия понижают до 50 мМ, Инкубацию продолжают 2 ч при температуре 37 С, и реакцию останаоливают нагреванием при телпературе 75 С о течение 10 лин. Полноту ограничения контролируют методом электрофореза о 1 о -ных агарозных гелях.В, Связыоание и выделение рекомбинатных фагов,Ограничен н ые ДН К слешивают и связывают с применением двух единиц Т 4 ДНК лигазы в смеси, содержащеи 50 мМ ТрисНС (рН=8), 10 мМ сульфата магния, 10 мМ 2-меркаптоэтанола и 0,1 мМ АТФ. Реакцию продолжают 10 - 15 ч при температуре 10 С, После связывания аликвотные части 0.2 мкг ДНК смешивают с АТФ ля получения конечной концентрации 10 М, Эти аликвотные части подвергают инкапсидации 1 п ч 11 гои применяют для инфицирования штаммаНВ :01 Ес.соИ. Было получено около 1,6 х10 ПОЕ(пятнообраэующих единиц) на 1 мкг5 лямбда ДНК, Некоторые из этих фагов проя вля ют ам ил азную активность (обнаружение амилазной активности на чашках Петрии выделение и очистку фаза - см, пример 1).Наблюдалось довольно большое содер 10 жание продуцирующих амилазу фагов (1 в400). Один был отобран и обозначен каклямбда чМ 781 альфа Агпу 1. Он сдан на хранение в Национальную коллекцию промышленных бактерий 12 фвораля 1980 г. под15 номерогл МС 1 В М 11572.С. Повторное клонирование гена амилазы из лямбда ММ 781 альфа Агпу о плазлидурВ В 322,1 мкг ДНК лямбда ИМ 781 альфа Агпу 1 и20 такое же количество ДЕК из плазмиды рВВ322 разрезают Е.соИ Впри обычных условиях. Связывание и трансформацию выполняют по методике, описанной в примере 1.Колонии Е. соИ НВ 101. содержащие реком 25 бинантную плазмиду, обнаруживают поамилазной активности, Одна такая колонияотобрана и обозначена Е, соИ С 7002(рСр 2), Она сдана на хранение в Национальную коллекцию промышленных бактерий 1230 февраля 1980 г. под номером ИС 1 В Р11573.Амплификация гена.Амплификация кодирующего амилазугена лямбда ИМ 781 альфа Агпу 1 и продуци 35 рование амилазы осуществляют следующимобразом. Бактерию-хозяина (Е.соИ НВ 101)культивируют оВ среде с 2 мЫ хлорида. магния при температура 37 С до достижения оптической 0,3 (650 нм), Затем добавля 40 ют лямба ММ 781 альфа Агпу, при этомколичество фагов было рассчитано так, чтобы множественность заражения составлялаприблизительно 1 - 2, т,е, один или доа фагана одну бактериальную клетку. Затем про 45 должают культивирование при энергичномперемешивании при температуре 37 С допонижения оптической плотности. Когда оптическая плотность понижае ся ниже 0,5,культуру собирают и помещают на лед, Куль 50 туру,. центрифугируют и всплывший слой испытывают на амилазную активность,Амплификацию и продуцирование фермента Е.соИ 7002 (рСр 2) осуществляют пометодам насыщенной культуры и амплифи 55 кации хлорамфениколом, как описано в примере 1,Амилазную активность определяют пометоду ДНС и о лизате фага, и о культурахЕ.соИ, содержащих рекомбинантные плазмиды, 1838410 1010 15 20 25 30 35 40 45 50 55 В случае применения фага (лямбда ИМ781 альфа Агпу 1) весь фермент выделяетсявследствие лиэиса клеток и, следовательно,находится в культуральной среде, В случаеприменения плазмиды большая часть фермента (96) находится в клетке.О. Повторное клонирование в дериватфага лямбда, способный к лизогенизацииЕ.соИПрименяют бактериофаг лямбда Т 4 ИдС 857 вам Ьаа эагп (лямбда ИМ 989),Этот фаг содержит ген ДНК лигазы бактериофага Т 4 и способен к лизису Е.соИ,Кроме того, он содержит теплочувствительный ген иммунитета и двеамбер-мутации вгене Е и гене Я соответственно, Мутациягена не дает бактерии лизоваться под действием инфекции этим фагом, Целью субклонирования была замена гена ДНКлигазы геном, кодирующим амилаэу,ДНК фага и плазмиды (рСР 2) были разрезаны Е, соИ Ю и фрагменты были связаны.ДНК фага, полученная в результате лигации,была затем упакована и ч 11 го и пятнаиссле.довали визуально путем посева на штаммЕ,соИ Яир Е, Яцр Г, Пятна, показывающиеамилазную активность, собирают и фаг очищают по вышеописанной методике.Затем этот фаг применяют для лиэогенизации штаммаЕ.соИ С 1 600 (С 1 1205) пообычной методике, Лизогенные колониипроверяют визуально на крахмалсодержащей среде с применением метода окрашивания иодом. Полученный при этом штаммобозначен Е,соИ С 7003 (лямбда альфаАиду) и сдан на хранение в Национальнуюколлекцию промышленных бактерий 6 марта 1980 года под номером МС 1 В М 11586.Амплификацию гена осуществляют следующим образом, Лизоген выращивают притемпературе 32 С. в средеВ до плотности0,8 при 650 нм, затем его центрифугируют иклетки суспендируют в свежей среде 1 В,предварительно нагретой до температуры45 С. Потом культуру инкубируют в водянойбане при температуре 45 С в течение 15 минс целью индуцирования литического цикла(так как ген иммунитета является теплочувствительным),Затем продолжают инкубацию приэнергетичном перемешивании при температуре 37 ОС в течение 3 ч, после чего определлют амилазную активность вовсплывшем слое и в клетках,Выделение и характеристика амилазы,полученной иэ лямбда ММ 781 альфа Аву,Е.соИ С 1 7002 (рСР 2) и Е/соИ С 7003 лямбда альфа Агпу 1).Как в примере 10 применяют метод "осмотического удара" для выделения фермента. Кроме того, так как фермент согласно этому примеру является термостабильным, он мог быть далее очищен путем добавления к водному 1 О мМ раствору Са, подогрева раствора до 80 С и выдержки в течение 10 мин, в результате такой обработки все протеины Е.соИ осаждаются и можно получить альфа-амилаэу в исключительно чистой форме, фактически никакие другие ферменты не присутствуют.Была определена специфичность альфа-амилазы, она активна к амилазе и крахмалу, продуктами гидролиза являются глюкоза, мальтоза и мальтотриоза со следами компонентов с большим молекулярным весом, Этот фермент не активен к циклодекстрину, Была также исследована теплостойкость фермента и оказалось, что она очень высока, Оптимальная температура активности с 0,5 амилозы находится в интервале 80 - 90 С, С 8 -ным растворимым крахмалом оптимальная температура составляет около 100 С,П р и м е р 3. Субклонирование плазмиды рСР 2 в плаэмиду рС 194 и экспрессия новой плаэмиды в ВасИоэ ыЬИэ.Настоящий пример иллюстрирует методику, по которой рекомбинантной ДНК, полученная в соответствии с настоящим изобретением, может быть экспрессирована в бактерии-хозяине, отличной от Е,соИ, а именно в штамме ВасИ 1 цэ эЬ 1 Ив,Плазмида рСР 2 (из примера 2) содержит фрагмент размерами 3,31 килобаз из донора. В,соаци 1 апз, кроме того, плазмида характеризуется тем, что сообщает сопротивляемость к ампициллину и тетрациклину и содержит два участка ограничения для каждого из й.соИ В 1 и Н 1 пб 111, Плазмиду рСР 2 расщепляют на 4 фрагмента Е/соИ 81 и Н 1 пб 111, обрабатываютлигазой и применяют для трансформации НВ 101, как в предыдущих примерэх,Полученные новые плазмиды, обозначенные как рСР 2,3, имеют фрагмент 2,64 к ил обаз ДН К В,со а 9 и а п з, причем указанный фрагмент содержит ген, кодирующий альфа-амилазу, Плазмида рСР 2,3 имеет один участок для каждого Е.соИ Ви НпдИ 1 и придают им ампициллиновую и тетрациклиновую сопротивляемость.Для следующей стадии выбирают плазмиду рС 194, которая известна своей способностью к репликации себя в ВасИ 1 оз вводаэ. Плазмида рС 194 придает хлорамфеникольную сопротивляемость и имеет один участок Н 1 пс 111,рСР 2,3 и рС 194 были обработаны 1-Ипб 11 смешаны и легированы для образования новой плазмиды, обозначенной рСН(ед/л)150 25 Составитель С. СветлышевРедактор В. Трубченко Техред М. Моргентал Корректор М, Шароши Заказ 2905 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 1, содержащей кодирующий альфа-амилэ:.у ген и имеющей хлорамфеникольную и ампициллиновую сопротивляемость, хотя уровень хлорамфеникольной сопротивляемости Е,со был низок. Как и прежде, препарат был применен для трансформации Е,со НВ 101.Штамм мутанта ВлоЬОз, обозначенный В 1133, не проявляющий альфа-амилазной активности, был затем обработан в соответствии с методом для образования протопластов. Затем протопласты трансформируют рСН 1 по методике трансформации в среде полизтиленгликоля Чана и Когана.Госле этого протопласты инкубируют в богатой среде в течение 1,5 ч, чтобы плазмидэ в бактерии зкспрессировала сопротивляемость к хлорэмфениколу,Затем протоплэсты сеют на регенерационную среду, к которой добавляют хлорамфеникол в количестве 20 мкг/мл. После инкубации в течение двух суток при температуре 37 С появляются колонии трансформированных клеток, зто колонии, проявляющие альфа-амилазную активность, которые могут быть обнаружены окрашиванием парами иода. Один клон, обозначенный 5 В.зоЬ 13 С 8001(рСН 1), сдан на хранение13 января 1981 г, под номером ПАСВ М 116929, Исходный штамм ОВ 1133 тоже сдан на хранение 13 января 1981 г. под номером ИСВ М 11628.10 В.зиЬ 13 С 8001(рСН 1) стабилен только в присутствии хлорамфеникола, Он может быть применен для продуцирования альфа-амилазы путем культивирования в среде, содержащей хлорамфеникол (20 15 мкг/мл), Альфа-амилаза может быть легговыделена из культуральной жидкости.После культивирования в течение ночив присутствии хлорэмфеникола количество продуцированной альфа-амилазы было сле дующим;Всплывший слой Клетки
СмотретьЗаявка
3451221, 11.06.1982
СПС Интернэшнл Инк
ЧАРЛЬЗ ЭНТОЙН КОЛЬСОН, ПИРР ЭМИЛ КОРНЕЛИС, КОЛЕТТ СИМОН ДИГНЕФФ, РАУЛЬ Г. П. ВАЛОН, КОРРИНЕ ВАЛОН
МПК / Метки
МПК: C12N 15/00
Метки: альфа-амилазы
Опубликовано: 30.08.1993
Код ссылки
<a href="https://patents.su/6-1838410-sposob-polucheniya-alfa-amilazy.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентов СССР">Способ получения альфа-амилазы</a>
Предыдущий патент: Иммобилизованная аденилатциклаза чумного микроба
Следующий патент: Способ получения рекомбинантной плазмидной днк и способ получения зимогенной формы белка с человека
Случайный патент: Теплообменная выработка