Способ определения розеткообразующей реакции нейтрофилов

ОЮЗ СОВЕТСКИХОЦИАЛИСТИЧЕСКИЕСПУБЛИК 556 А 05 6 01 й 33/53 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Е у,ой медицинииа и Г.Г.Рожбразующая мфоцитов у ой недостаМ 1,с,64 -помещают в стек- пробирку, смоченнтрации из расчета ОЧ ОО арной взвеси.сь получают путем питической жидкого раствора хлори- ЭДТА рН 7,2-7,4. К нтрифугирования бавляют 1 мл гемолитичеа 30 с при постоянном потем добавляют 25 мл екращения действия гемоости на клетки. Центрифу об/мин, сливают идкость, осадок осторожно опученному осадку клеток клеткам крови д ской жидкости н мешивании, За среды 199 для пр литической жидк гируют 10 мин надосадочную ж встряхивают, К и ОСУДАРСТВЕ ННЫЙ КОМИТЕТО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМРИ ГКНТ СССР(71) Кубанский государственныский институт им. Красной Арм(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕ НИЯ РОЗ ЕТКООБРАЗУЮЩЕЙ РЕАКЦИИ НЕЙТРОФИЛОВ(57) Использование: предложенное изобретение относится к медицине и может быть Изобретение относится к медицине и может быть использовано в практике клинической иммунологии для диагностики первичных и вторичных иммунодефицитов по системе нейтрофильных гранулоцитов (ГГ), с целью прогнозирования течение различных заболеваний бактериальной, вирусной и аллергической природы, мониторинга иммунного статуса при проведении иммунокоррекции дисфункций Н Г,Целью изобретения является упрощение и ускорение способа.Способ осуществляют следующим образом.Подготовка клеток, Забор крови. Кровь получают из безымянного или указательного пальца. Кровь в объеме 0,5 мп самотеком набирают в, капилляр, смоченный 2,7 -ным использовано. в практике клинической иммунологии для диагностики первичных и вторичных иммунодефицитов по системе нейтрофиловых гранулоцитов (НГ), Цель - ускорение и упрощение способа. Сущностью предложения является экспресс- метод определения розеткообразующей способности НГ в капиллярной крови, при этом эритроциты разрушают гемолитической жидкостью, .а отцентрифугированную взвесь помещают в лунку планшета, фиксируют 0,05 мл 0,6 - 10/ р-ра гпутаральдегида в течение 5-7 мин, а затем фиксацию останавливают встряхиванием планшета, и в препарате-капле выявляют розеткообразующую способность НГ известным способом.1 табл. раствором ЭДТА. Кровь лянную центрифужную ную ЭДТА той же конце 10:1,Выделение лейкоцит Лейкоцитарную вэве лизиса эритроцитов гемо стью состава: 0,083-но стого аммония +0,04 г/л оставшимся после це1758556 Показатели Прототип 3 - 5 млКровь венозная 0,1 мл Расход крови 0,5 Кровь капилярная 0,05клеточной суспензиисход реактивовикол верографииглутаральдегидтраты времени наовку реакции р ЕРЕНество обследованныхи постановке методаа 1 абочий ень 0.6 1,30 - 2 ч 8 - 16 2 - 64 добавляют среду 199 в количестве 0,3-0,4мл. Ресуспендируют,Постановка реакции роэеткообразоваПостановка рЕ-РОН,В лунку планшета наливают 0,05 мл полученной суспензии лейкоцитов, добавляют0,05 мл 2,5 ф,-ный суспензии эритроцитовбарана (ЭБ) трижды отмытых физраство 1,ором. Инкубируют в течение 5 мин при 4 С.Цеитрифугируют в течение 5 мин при 1000об/мин. После центрифугирования в лункиосторожно, чтобы не взболтать осадок, добавляют 0,05 мл 0,6 - 1-ный раствор глутаральдегида, Выдерживают при комнатнойтемпературе 5-7 мин. После этого надоса.дочную жидкость удаляют одновременно издвух лунок планшета быстрым интенсивнымвстряхиванием, Затем в лунки заливают по0,1 мл физраствора или среды 199. Осадоктщательно ресуспендируют и готовят препарат-каплю,Постановка пЕ-РОНВ лунку планшета заливают 0,05 мл лейкоцитарной суспензии, добавляют 0,05 мл2,5%-ной суспенуии ЭБ. Планшет инкубируют 20 мин при 4 С, Центрифугируют 5 минпри 1500 об/мин, Далее следует повторнаяинкубация 60 мин при 4"С, Затем фиксируют 0,05 мл 0,6-1%-ным раствором глутаральдегида в течение 4-7 мин,Останавливают фиксацию интенсивнымвстряхиванием планшета, Добавляют 0,1 млсреды 199, ресуспендируют. Готовят препарат-каплю,Подсчет розеткообразующих клеток.Высушенные мазки Фиксируют в метаноле в течение 10 мин окрашивают раствором азур-зозин рН 6-6(по Романовскому) втечение 5 мин, Ополаскивают водой, сушатна воздухе, подсчитывают количество розеткообразующих нейтрофилов на 100 нейтрофилов,Способ апробирован на 180 работникахАпшеронского деревообрабатывающего комбинат.", которым проводился мониторинг иммунного статуса с целью выявленияиммунопатологических состояний. При этомпараллельно оценилось состояние здоровья5 работающих и уточнялись клинические признаки иммунодефицита. Установлено, что у15.46% рабочих имеется дефицит рЕ-РОН,у 5,0% - поздних Е-РОН; гиперфункция НГобнаружена по рЕ-РОН у 28,12 обследован 10 ных лиц, по и Е-РОН - у 52,48%, Выявленныедисфункции рецепторного аппарата в87.5% случаев совпали с клинически выявленными признаками иммунопатологических состояний, которые выражались в15 наличии хронической бактериальной инфекции, персистирующей вирусной инфекциилица длительно и часто болеющие), аллергическими и аутоиммунными процессами.Преимущества предлагаемого способа20 представлены в таблице,Таким образом. имеется явное преимущество при использовании предлагаемогоэкспресс-микрометода при массовых эпидемиологических обследованиях и проведе 25 нии мониторного иммунного статуса у лицс вторичным ИДС, находящихся на иммунокоррекции.Формула изобретенияСпособ определения розеткообразую 30 щей реакции нейтрофилов, включающий выделение лейкоцитов из крови, инкубацию сэритроцитами барана, фиксацию глутаровым альдегидом, остановку фиксации и подсчет розеток в ранней и поздней35 субпопуляциях нейтрофилов, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью упрощения иускорения способа, выделение лейкоцитовосуществляют с помощью гемолиэа эритроцитов растворов хлористого аммония из40 микрообаемов крови, инкубацию с эритроцитами барана ведут в лунках планшета,фиксируют 0,6-1%-ным раствором глутарового.альдегида в течение 5-7 мин, далееудаляют фиксатор встряхиванием планше 45 та. Предлагаемый экспресс- мето