Способ получения полиэфирного антибиотика а 80190

/ 1/О ОБРЕТЕНИЯ САН ПАТЕНТУ Ф 47компани (08)лл, Раймонд Че Фоноек О 8).8)Ф 673184,79. Р 21647973. 3839558, 971. эстли, А 801 90 класса 1 б, тииров, потому что альную систему.пы включают и 11 и А.структуру: Испольэу ,. является но па (1), груп он имеет од Другие член АА и А 80 90 имее систему ым членом ы полиэф спироке этой гр В, А 2041 следующуя к новому поА 80190, к нем к его полу- новых штаммов М е Йе О 90Рме) нм особенности А 801900190 приписывают стнную на рентгено-ких исследованиях. тной. ернне его свободной к ет следующие ха ХарактерныАнтибиотику Атуру 1 основталлографиче с ук со еннос ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯПРИ ГКНТ СССР(71) Эли Лилли Энд(56) Патент СССРк 5 з, С 12 Р 1/02, 19Заявка Франциикл. А 6 К 21/00, 1Патент США Укл. А 61 К 21/00, 1 Изобретение относит иэфирному антибиотику оторым производным ег ению культивиров анием икроорганиэмов,(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИЭФИРНОГОАНТИБИОТИКА А 80190(57) Изобретение относится к новому полиэфирному антибиотику А 80190 и некоторым производным его, к его получению культивированием новых атаммов микроорганизмов. Антибиотик А 80190 получают путем культивирования штамма микроорганизма Асйцпоаайита о 1 щ 8 оврогцв 15877 ипи штамма микроорганизма Ассцпошайцга о 11 доврогцв 15878 на питательной среде, содеркащей усваиваемые источники углерода, азота и неорганических солей в условияк глубинной аэробной Ьерментации при 30 - 32 С, 12 табл.19 1531861Цыплят содержат на соответствую щих рационах в течение определенного периода времени, обычно 7 дней, Для лечения используют четыре группы цып лят. гсБалльные оценки кишечного повреждения А 80190 (ррш) приведены втабл, 1 О.Балльные оценки цекального повреждения А 80190 (ррш) приведены втабл. 11,Привес (г/цыпленок) А 80190 (ррш)приведен в табл. 12.10 фо рмула изо 6 ре тек ияСпособ получения полиэфирного антибиотика А 80190 формулы ЯМе Ме 1 Ме 0 ГИе Ие Ме во о о которой ние шЙцга Энит МВф 30 лкил сложиэфир производное,бли ЮЮО; 158.масг Агаров асреда Избыточный39, Зел;желтый. КрасныйУс тричный43. Краснткоричневый56. Темно-коричневыйОто.ОтсутствуетОчень. светлоХороший (влажная поверхность) ст 61. Зелен.анжелричневый Отсутствует Очень светло БМ, РП: коричневый-коричнеПосредственный5. Молочный. Розовый Отсутствует ост:С:М: ый лый анмко в тсутствуетт посредственног Рост: ох ло Испытание. Цыплят инокулируют200,000 ооцистами Е 1 пог 1 а асетоо 11 па-СОМНИ1 фалкип, арил, алкил-арипарилалкил, галондарил,роарип, галоидарилалкилалкоксиарип, арилоксиаарипциклоалкил, ациларпиклоалкип, ипи ацил,оэфирное или алкил выйПлохой93. Желтовато- Следы: черно-бНесколько разбных отдельных Отсутствует амма м В 1. 158 ржащей да, а ловиях и при ление соли, включающий культивиро" амма микроорганизма АсйЫо 118 оврогцв ЯВЮ 15877 или икроорганизма А.о 1 д 8 оврогцв 78 на питательной среде, соусваиваемые источники углеота и неорганических солей в глубинной аэробной фермента 30 - 32 С с последующим выантибиотика.21 153186 5,ОС: ВМ: РП:Рост:ОС:ВМ:РП:Рост: Отсутствуето рошийУстричныйОтсутствуетОтсутствует 1 ЯРУ 5 48,1 ЯР Нф 7 48. ОС: ВМ: РП: Рост: ОС: ВМ: РП: Рост: Чапека 93. Эмерсона Хороший ОС: 267 . РП:Рост: Лс -ОС: Глюкоза+ +парагин ВМ: РП:Рост: Отсутствует Томатная пастаОвсяная Хороший Рост: мука ОС: 39. ВМ: Отсутствует РП:Рост: Дрожжи+ декстроза ОС: 59,78. ВМ: РП:Рост:ОС: Бутиратнатрия 93, Желтовато-серыйСледы: черно-белыйНесколько разбросанныхотдельных комковОтсутствуетПлохой93, Желтовато-серыйОтсутствуетОтсутствуетПлохой (влажная поверхность)79,1. Зел. в .желтый,Желтый, КоричневыйОтсутствуетСветло-коричневыйПосредственный93. Желто-серыйОтсутствуетОтсутствуетХороший (кромки, шелушащиеся с обратнойстороны)77, Молочный. Желт,коричневыйОтсу тс твует ОтсутствуетХороший (влажная поверхность)90. Зеленовато-желтый, 26,Жел тыйОтсутствует Избыточный ( влажнаяповерхность)79,1. Зел.-желтый,Желтый, Коричневый ОтсутствуетИзбыточный (влажнаяповерхность)81Теми,-эел.-жел, -коричневыйОтсутствует Темно-коричневыйХороший93, Желто-серый 22Продолжение табл.1 Молочный. РозовыйОтсутствует Посредственный7, Устричный Отсутствует Отсутствует Посредственный Желто-серый Отсутствует Отсутствует ЧерныйСледы: 5 ГеЗел. -желтый,Красно-коричневыйОтсутствуетХороший Б Желто-розовый ПосредственныйБелый - 7 са 1Желт,-розовыйОтсутствует Зел.-желтый.Красный, УстричныйСледы. 2 Белый(зоны ингибирования). риме ч ан КонтрольныйАдоиит1-АрабинозаЦеллобиоз аЦеллюло з аДекстранР-Фруктоз аР-ГалактозаР-ГлокозаБис иноз итИнулинО-Лак то заМаннитР-Манноэа0-Иелеэитоза БацитрацинЦефало т инГентамицинЛинкомицинНеомицинОпеандомицинПенициллин СРифампинСтрептомицинТетрациклинТебрамицинВанкомицин 0-Мелибиоза РаФфиноза 1 -Рамно за Рибоза Салицин Сахароза Трегалоза Ксилит Э-Ксилоэа53186 Таблица 4 Сходства Различия Антибиотическая устойчивость Морфология Физиологи ческиесвойства Картина использованияуглеродаКультуральные характерис тики Деградация эскулина,деградация гипоксантина, редуиирование нитратаФорма и размеры спорТемпературный пределПродупирование уреазы Тест Образование воздшуных гифовКартина использования угле рода Редко Редко(сметабл, 2) Различная Каталазная де градация:аде нинакальциевой соли яблочной кислотыказеинамитинаДНКэластинаэксулннааелатиныгуанинагипоксантина Краснооранзевый Бес цве тный Синтез полиэфираДефицит воздушных гифов кератинакрахмалатестостеронатирозинаксантинаКультивирование в жидкойсреде Культивирование на бутирате МаПродуцирование Н Я Меланоидные пигменты Толерантность к НаС 1, Х Таблица 5 ЯВВ 1.5878 А.масга, табл, 3)Не проводилиКоричн. -форанж.КоричневыйК-ИГладкая15 - 37 Различная Зелен.- коричн,КоричневыйК - ИГладкая15 - 42Ф ПродолговатаяОт 0,5-0,7 до О, 9-1, 3 р в ОвальнаяОт 0,8-1,0 до1,2-2,0 ря Содержание Составная часть Редуцирование нитратафосфатаэаСинтез полиэфираКартина УФтойчивоФти к антибиотикам Устойчивость к лизоцимуОкраска обратной стороны Растворимый пигментПепи спорПоверхность спорТемпературный предел, СПродуцирование уреазыформа спорРазмеры спор Молотая желтая кукуруза Соевая мука Фо снятой кожицей, экстрагированная растворителем, тонко размолотая, 503 белкаЖивотный жир (топленый говяжий жир)Высушенная рыбная мука с растворимыми веществами (ЬОХ белка)Кукурузная барда с растворимыми веществамиДикальций фосфат, кормовой сортКарбонат кальцияВитаминный премикс (представляющий витамины А, Э, Е, К и В , холин, ниацин, пантоафгеновую кислоту, рибофлавин, биотин с глюкозой в качестве наполнителя )Следы минерального премикса (представляющего МпБО 2 пО,КС, РеЯО , СаСО )2-амино-оксимасляная кислота (оксианалог метионина) А 80190 (Ка-соль) Продолжение табл.5 Таблица Ь Х кг (фунты) 50 453,Ь (1000) 31,09 282,05 (621,8) 6,5 58,97 (130) 5,0 45,36 (100)4,0 36,29 (80) 1,8 1 Ь,ЗЗ (36) 0,9 7,26 (16) 0,5 4,54 (10) О 2 1 81 (4) 0,1 О, 91 (2)0,01 0,09 (0,2)29 30 153 86 Таблипа 7 Содержание Составная часть кг (фунты) 67,8 615,08 (1356)1 О 90,72 (200) Тонко размолотая кукурузаМолотая кукурузная початкаОбезвоженная люцерновая мука, 177 белкаСоевая мука со снятой кожицей, экстрагированная растворителем, 503 .белкаТростниковосахарная мелассаИочевинаА 80190 (Ма-соль)Дикальций фосфат, кормовойсортКарбонат кальцияХлорид натрияСледы минерального премиксаВитамины А и 0 премикс фВитамин Е премикс ф "Пропнонат кальция 45,36 (1 ОО)(10,0) (10,0) (6,0) (О, 6) (1,4) (1, ОЭ (3, 0) 4,54 4,54 2,72 0,27 О, 635 О, 454 1,36 0, 0,5 0,3 0,03 0,07 0,05 0,15 Содержащий на фунт (453,6 г) й 2,000.000 М.Е, витамина А, 227.200 И.Е. витамина Р и 385,7 г соевого корма с до бавлением 1 Х масла.Сухая кукурузная барда с растворимыми веществами, содержащими 20,000 М.Е. 0-альфа-токоферилацетата на Фунт. Таблица 8 Содержание Составная часть 3 кг/т (фунт/т) 65,10 590,59 (1 302) Молотая желтая кукурузаСоевая масляная мука со снятойкожицей, экстрагированная ра"створителемВысушенный свекловичный жомДикальций фосфатКарбонат кальцияСвиной витаминный премиксСоль (КаС 1)Холин хлорнц,Следы минерального премикса 167,83 (370) 90,72 (200) 26,31 (58) 10,89 (24) 9,98 (22) 4,99 (11) 3, 175 (7) 1,36 (3)31531861 32 Продолжение табл.8 Содержание Составная часть Х кг/т (фунт/т) Витамин А - премикс +Окси-аналог метнонина 0,10 0,91 (2)О, 05 0,454 (1) 11 кг премикса содержит следукнцие составные части: 77.161 Е. Государственной фармакопеи С 1 А(0 ЯР) витамина Р, 2,205 И.Е, витамина Е; 441 мгрибофлавина; 1,620 мг пантогенной кислоты;2,205 мг ниацина; 4,4 мг витамина В,; 441 мг витамина К; 19,180 мг холина; 1 О мг дюлиевой кислоты; 165 мг пирндоксина; 110 мг тиамина и 22 мгбиотина.1 кг премикса содержит следующие составные части: 50 г марганца в виде сульфата марганца;100 г цинка в виде карбоната цинка; 50 г желеэав виде сернокислой, соли эакиси желеэа, 5 г медив виде окиси меди; 1, 5 г йода в виде йодида ка"лия и 150 г максимум и 130 г минимум кальция ввиде карбоната кальция." 1 кг премикса содержит 6,6138 00 УЯР Е. витамина А. Таблица 9 Соде рж ан ие,г/кгСоставная часть 150,0 20,0 Активное соединениеСиликат кальцияКарбонат кальция(мука иэ устричнойскорлупы) 830,0 Таблица 10 Никарб аз ни(рра) 20 12 261 272 279 251 266 283 Составитель И.ТарееваРедактор А,Мотыль Техред Л.Олийнык Корректор М.Максимишинец Заказ 7971/59 Тираж 501 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, 3-35, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. ужгород, ул. Гагарина, 101 0 20 30 40 50 125 0 20 30 40 50 25 3,44 3,19 3,50 3, 17 3,19 0,33 147 159 174 211 222 279 2,63 2,38 0,92 1,00 0,54 236 268 279 258 276 1,75 0,3 0,1 9 0,58 265 284 258 289153186 ОИеИе ОМе Ме 1 Ие ОМе ф"4,Стймкот до Ст.е, р ик алы рмуль 1 а в ко т.п. ров,Состояние: белые кристаллы (из ацетона - воды)Т.пл, 98 - 100 или 120 - 122 С (более часто); вероятно изменяется со степенью сольватации, рКа " 6,2 (66 Х-ный водный диметипдюрмамиц)а(3 26 С (с 1, СНС 1 ), Кол.масса 828 (масс-спектрометрия с десорбированНым полем). УФ: поглощение отсутствует. ИК: (СНС 1 З). Показы вает поглощение при следующих частотах, см : 3019, 2970, 2936, 2827, 3721, 3457, 1402, 3376, 1334, 3163, 1105, 1092, 1083, 1056, 1022, 1006, 989, 980, 945, 934, 917, 892 и 859, 15Вычислено, Х: С 63,77; Н 9,18;О 27,05. С 431 тьОмНайдено, 7.: С 63,35; Н 9,17;О 27, 30. 20Растворимость. Нерастворнм в воде,растворим в низших спиртах, таких какметанол, кетонах, таких как ацетон,сложных эфирах, таких как этилацетат,К представляет водород ипи- СОХНК- алкип, арил, алкип-арил,арилалкип, галоидарил,нитроарил, галоидарилалкил, алкоксиарил, арилоксиарил, арипциклоалкип,ациларип и циклоалкип,или ацип, алкип сложноэфирные ипи алкип-эфирные 4производные,иди его соли,А 80190 и его производные являются полезными в качестве антибактериальных и антипротоэойных средств, Они улучшают эффективность использования кормов жвачными животными и действуют в качестве средства, способствующего росту животных с одной желудочной полостью. Кроме того, они имеют55 инсектицидную, гербицидную и противо- вирусную активность. Кроме того, они являются полезными в качестве ионогалоидированных углеводородах, такихкак хлороформ и углеводородах, такихкак диэтиленовый эфир, бенэол, толуоли теплый гексан.А 801 90 имеет кислотную Функиио,способную образовывать соли и сложноэфирные производные, и имеет по край-,ней мере одну гидроксипьную группу,которая может быть этериФицированаипи может образовывать эфирные производные или уретановые проызводные,Ациловый и алкиловый сложные эфиры иалкиловые эфирные производные А 801,90,уретановые производные, фармацевтически приемлемые солиА 80190 и этихпроизводных также являются полезнымив качестве антибиотиков, коксидиостатков и в качестве средств, которыеувеличивают эффективность испольэова"ния кормов животными,Согласно цели изобретения в описании предлагается соединение Форму"лы (1) Ие Ие,МеИе Н Н ОНОВ Термин "ациловый означает отдо С, предпочтительно от Салкановый кислотный остаток,рой К 1 а представляет от С долкил ипи водород, например Фо цетип, пропионип, бутирил и Термин циклоалкип" означает циклические углеводородные группы, содержащие 3-7 углеродных атома, такие как циклопропип, циклобутип, циклогексил и другие, причем циклогексип является предпочтительныч, Биклоалкипьная группа может быть замешенной арильным остатком, например 2-(фенил) -циклопропилом,Термин "алкокси" означает низшую от С, до С алкильную группу, имеющу замешенную кислородную Функцщо в иейтакую как метокси, этокси, пропоксии т,п.Термин арип" означает ароматический остаток, полученный удалениематома водорода из ароматического углеводорода, такой как, например, Женил, пиридип ипи фурил, особенно фенил. Арипьный остаток может быть эамещенным различными группами, Заместитель на фенипьном ядре расположенпредпочтительно в положении 4, Примерами являются 4-алкиларил, например4-метилфенил (4-толип); 4-галоидфенил, например 4-хлорфенил; 4-нитрофенил; 4-арилоксиарил, например 4-феноксифенип; 4-алкоксифенип, например4-метоксифенил; 4-(алкилкарбонип) -фенип, например 4-(метилкарбонип) -фенипили 4-(фенилкарбонип)-фенип. 20Термин "алккп" означает С,-Суглеводород с линейной ипи разветвленной цепью, предпочтительно С,-Суглеводород, например метил, этип, пропил, изопропип, н -бутип и т,д, Алкипьная группа может быть замещеннойарильным остатком, как это определеновыше, чтобы образовать арилалкипьныйостаток, например фенилэтил ипи 2-фенипэткп, ипи галоидарипьным остатком, 30чтобы образовать галоидарилалкипьныйостаток, например 4-бромфенэтил,Соли А 801 90 и его производных являются полезными для разделения иочистки антибиотиков. Особенно полезными являются фармацевтически приемлемые соли. Такие соли должны иметьмалую или вовсе отсутствующую токсичность по отношению к теплокровным животным. Примерами солей являются соли А 80190 и его производных щелочныхметаллов, щелочно-земельных металлови аминов.Соли А 80190 щелочных металлов ищелочно-земельных металлов включают 4соли натрия, калия, лития, цезия,рубидия, бария, кальция и магния.Аминовые соли А 80190 включают солиаммония и первичного, вторичного итретичного С, -С алкиламмония и оксиС-С,1 алкипаммония. Аминные соливключают соли, образующиеся по реакции А 80190 с гидроокисью аммония, метипамином, вторбутипамином, изопропипамином, диэтиламином, дииэопропиламином, этаноламином, триэтипамином,3-амино-пропанолом и т.п.Широко известно в ветеринарнойфармацевтической области, что форма антибиотика обычно не является существенно важной при лечении животного антибиотиком, В большинстве случаев состояние животного изменяетформу лекарства, отличающуюся отформы, которая была введена.Солевая форма, в которой оно моглос,быть введено, не является, следовательно, существенно важной. Однакосолевая форма может быть выбрана по причинам экономии, удобства и отсутствиятоксичности,Антибиотик А 80190 может быть получен культивированием А 801 90 - проду-цирующего штамма Асг 1 пошадцга о 1 доарога при глубинных аэробных условияхв подходящей питательной среде дотех пор, пока не будет достигнутазначительная антибиотическая активность. Антибиотик выделяют путем использования .разнообразных методик выделения и очистки, известных в даннойобласти техники.Новый Асг 1 пошайцга о 1 ддоврогамикроорганизм данного изобретения,который продуцирует антибиотик А 80190,выделен из образца почвы из Индии.Впоследствии значительно улучшенныйвариант, который продуцирует повышенные количества А 80190, бып выделенЛа-Верне Д.Доеком, Культуры этихдвух А 801 90 - продуцирующих организмов сданы на хранение и стали частьюколлекции культуры родов в СеверномРегиональном Исследовательском центре(Сельскохозяйственные исследования),из которой они доступны публике подинвентарными номерами БК 1 Ц. 15877 (родительский штамм) и ЯВ 1 ц. 15878 (штаммизмененной особи - вариантный штамм) .Согласно таксономическим исследова-ниям два новых микроорганизма классифицируют как члены нового вида рода Асг.1 пошадцга, для которого предлагается название Асгпопайцга о 118 оз-рога,Характеристики культур, Культивирование организма обычно слабое нахимически определенной среде, но более хорошее на комплексной органической среде. Воздушные мицелии отсутствуют, за исключением следовых количеств на 1 РЯ У 4 и натрий-бутиратном агаре. Если присутствуют споры,то их окраска устрично-белая по системе Треснера и Баккуса. Ивет обратной стороны от желтовато-зеленого докоричневого. Не продуцируются раство 1 5318 Ытестостерон, крахмал, тироэин ипи коан тин,Анализ клеточной оболочки. Гидролиэованные цельные клетки содержатмезоиэомер диаминопимелиновой кислоты. Сахары, присутствующие в гидролиэатах цельных клеток, следующие: глюкоза, манноза, мадуроэа и рибоэа. Типом клеточной оболочки согласно Бэккеру является шип Ш, а образец сахара является типом В. Качественныйанализ метанолизатов цельных клетокна миколевые кислоты дает сомнительные результаты. Сомнительно, чтокультура содержит миколевые кислоты.Бып обнаружен тип Р 1 фосфолипидногообразца. Тип Р 1 не содержит азотныхфосфолипидов и является характерньмдля рода Асг 1 повайцга,Подлинность штамма. МККЬ 15878имеет клеточную оболочку типа 11. ТипВ цельной клетки сахарного образца иТип Р 1 фосболипидного образца. Этахомотаксономическая информация вместес обвыли характеристиками культур согласуется с отнесением штамма к родуАсдповайцга по Лешевалье, Сравнениеего характеристик с таковыми в опубликованных описаниях известных видовАсТповайцга показывает, что культураподобна А.ре 11 ег 1 ег.Культура напоминает АсС 1 повадцгаре 11 егег главным образом по отсут-.ствию ули по крайней мере редкому наличию воздушных мицелий. Морфологияспорофоров, когда они продуцируются,подобна описанной в литературу Рз.Две культуры также обладают рядом физиологических характеристик. Однакокультуральные и физиологические различия являются достаточными, чтобыотделить их в качестве отдельного вида А.ре 11 егег вызывает деградациюэластина, гипоксантина, кератина; гироэина, использует трегалоэу, восстанавливает (Редуцирует) нитрат и куль"тивируют при 45 С, однако КККЬ 15878не имеет этих характеристик. Последний использует адонит и целлобиозу,вызывает деградацйо эскулина и ДНК иявляется устойчивым к лиэоциму, однако А.ре 11 ег 1 ег не имеет этих характеристик, Следовательно, новая культура является видом, отличным отА,ре 11 ейдег.Иэ-за подобности культуры А.масгаосуществляют одновременные лабораторные исследования ИККЬ 15878 и А.масримые пигменты, за исключением продуцирования очень светло-коричневогорастворимого пигмента в случае 1 БРУ 2 агара и темно-коричневого растворимого пигмента в декстрозо-дрояокевом агаре. В табл. 1,представленахарактеристика культур НККЬ 15878 иА.васга на различных агаровых средах. 1 О 5011 ККЬ 15878 культивируют при температурах 15-4 С при концентрации до 23 БаС 1. Он продуцирует каталазу,фосфатаэу и уреаэу.БККЬ 1 5878 деградирует каэеин, 55 ДНК, эскулин и желатииу, но не разлагает аденин, кальциевую соль яблочной кислоты, хитин, эластин, гуанин, гиппурат, гипоксантин, кератин, крахмал,Морфологические характеристики,Цепи спор продуцируют разбросанно на1 БР У 4 и натрий-бутиратном агаре.Спорофоры, содержащие приблизительно 1510 спор на цепь, в основном извилистые в виде вправо изгибающейся (КЙ) конфигурации. Однако наблюдаютсятакже крючковатые спорофоры. Воздушные гифы (нити грибницы ) имеют тенденцию группироваться вместе, Форма. спор продолговатая и изменяется поразмеру от 0,5 - 0,7 до 0,9 - 1,Заев,Усредненный размер спор составляет1,1 - 0,6 рв, Рисунок поверхностиспор гладкий.В табл. 2 приведена картина использования углевода штаммом НККЬ15878 по сравнению с А.масга, 1 БР(всреду У 9 используют в качестве ос 30новной) . Добавление витамина В 1 илииспользование среды Луйдемана способствует более хорошему культивированию,но не изменяет использование углерода. Использованы адонит, целлобиоза, 5глюкоза и рибоэа. Сомнительное использование отмечают в случае фруктозы и ксилоэы. Арабиноза, целлюлоза,декстран, галактоэа, цис-инозит, инулин, лактоза, маннит, манноэа, мелиэитоза, мелибиоэа, раффиноэа, раиноза, салицин, сахароза, трегалоза иксилит не используются для культивирования,В табл. 3 приведены данные об устойчивости штамма ИККЬ 15878 к разнообразным антибиотикам при укаэанныхконцентрациях и сравнение их с А.масга.1 О 15 га, которые обладают многими общимисвойствами. Оба не способны вызыватьдеградацию аденина, кальциевой солияблочной кислоты, х итина, элас тин а,гуанина, кератина, крахмала, тестостерона, тирозина и ксантина. Ни тот,ни другой не продуцирует НЯ или меланоидные пигменты. Обе культуры вызывают деградацию каэеииа, ЛНК и желатины, продуцируют каталаэу и фосфатаэу, а также синтезируют полиэфирныйантибиотик . Они имеют одинаковую толерантность к ЯаС 1, оба культивируются на бутирате натрия, они имеют одинаковый тип клеточной оболочки.А.масга и ЯВКЕ 15878 разливаютсяпо картине использования углерода, подеградации эскулина и поксантина, ус"тойчивости к антибиотикам, температурному пределу, продуцированию уреаэыи редуцированию нитрата.А.масга и ЯВКЕ 15878 обладают многими общими культуральными характеристиками, особенно отсутствием воздушных мицелей. Однако имеются и значительные различия. Обратная сторонаЯВКЬ 15878 от зеленой до желтоватокоричневой окраски, А,масга на многихсредах окрашивается в красный цвет.Это отличие наиболее четко проявляется на глюкозо-аспарагиновом агаре.На этой среде А.масга в отличие отЯККЬ 1 5878 продуцирует розовое воз- .душное разрастание. Эти культуральныесравнения показаны в табл. 1.Морфология ИККЕ 15878 подобная таковой А.масга. Обе имеют плохо развитые воздушные мицелии. Поверхностиспор гладкие. Различия и сходствамежду ИККЕ 15878 и А.масга изложеныв табл, 4,В табл, 5 показаны подробные сход"ства и различия ИККЕ 15878 и А.масга. Эти сравнения показывают, что ЯВКЕ 15877 и ИККЕ 15878 культуры значительно различаются от других видов Асгпошайцга и представляют штаммы нового вида, для которых предлагается название АсгЫошадога о 1 18 оарога - новый вид, Штамм ИВВЬ 15878 является типовым штаммом А.о 1 д 8 оарога. Как и в случае с другими организмами характеристики А 80190, продуцируюшей культуры данного изобретения, Асгпощайцга о 18 оарога ИКРЕ 15878 подвергаются изменению. Рекомбинанты, мутанты или варианты штамма могут быть получены путем обработки разнообразными З 1861известными физическими и химическимимутагенами, такими как ультрафиолетовый свет, рентгеновское излучение,гамма-излучение и химикалии, такие5как И-метил-И -нитро-И-нитроэогуанидин. Природные и индуцированные варианты, мутанты и рекомбинанты Асгьпошадцга о 1 д 8 оарага ЯККЕ 15877, кото 10 рые сохраняют характеристику А 80190.продуцирования, рассматриваются частью данного изобретения,Среда для выраи;ивания, используемая для культивирования культур Асг- пошайцга о 18 оарога, может быть любойиз ряда сред. Для экономиии при про-,дуцировании, получения оптимальноговыхода и легкости выделения продуктанекоторые среды для выращивания явля 20 ются предпочтительными, Так, например, предпочтительным углеводным источником при крупномасштабном Ферментировании (брожении ) является глюкоза, хотя могут быть использованы25 также рибоза, ксипоза, фруктоза, галактоза, манноза, маннит, картофельныйдекстрин и т.п, Глицерин и липиды поддерживают незначительно иливовсе не поддерживают культивирование ипи продуцирование антибиотика,когда используются в качестве главного источника углерода. В сочетании сглюкозой они увеличивают биомассу,но уменьшают продуцирование антибиотика,Предпочтительным источником азотаявляется гидролизат коллагена, хотяполезными являются также энзим - гидролизованный казеин, пептоны из мяса,40 рыбная мука, мука иэ печени и т.п.Среди питательных неорганических солей, которые могут быть внесены всреду для выращивания, обычными являются растворимые соли, способные да 45 вать цинковые натриевые, магниевые,Экальциевые, аммонийные; хлоридные,карбонатные, сульфатные, нитратные иподобные ионы.Ценные следовые количества элементов, необходимые для роста и развития организма, также должны быть включены в среду для выращивания. Такиеследовые количества элементов обычновстречаются в виде примесей в других55 заменителях среды в количествах, достаточных для удовлетворения культивируемых требований организма, Пенообразование обычно не является проблемой, но малые количества (.т.е.12 1 531861 110,2 мл/л) антивспенинающего агента,такого как полипропиленгликоль, могутбыть добавлены в крупномасштабнуюферментационную бродильную среду 1если это необходимо,Для продуцирования значительныхколичеств антибиотика А 80190 глубинная аэробная ферментация являетсяпредпочтительной. ОП р и м е р 1. Получение А 80190.А. Ферментация А 80190 но нстряхиваемой колбе. Культуру Асй 1 пошайцгао 1 д 8 оврога ИВКЬ 15878 в ниде лнофилиэированной пилюли либо в виде суспензии, содержащейся в жидком азоте,используют для посева на среду следующего состава, мас.Х: глюкоза 1,0;растворимый крахмал 2,0; дрожжевойэкстракт 0,5; энэиматический гидролиэат каэеина (ИЕ амин А, Шеффилд Кемикал Ко, Норвич, Нью-Йорк) 5,0; СаСО0,1. Деионизированная вода (количество раствора) 1 л. ИаОН добавляют,чтобы повысить рН среды примерно до7,2 до стерилизации.Наклонные плоскости и пластины готовят добавлением 2,57. агара к посевной среде . Микроорганизмы на наклонной плоскости инкубируют при 30 С вРтечение примерно 10-14 дней. Созревшую на наклонной плоскости культурусоскаблинают с помощью стерильногоинструмента. Около одной четвертиосвобожденных спор и выращенной куль" 35туры, полученных таким образом, используют для засева 50 мл посевнойсреды первой стадии,Привитую среду первой стадии инкубируют в колбе Эрлеймейера емкостью 250 мл при 30 С в течение 48 чна встряхинателе с круговой орбитойн два дюйма (5,08 см) при скорости250 об/мин. Эту среду (0,4 мл используют для посева 50 мл продуцируемой среды, имеющей следующий состав,Х: глюкоза 3,0; И 2 амин А 0,4; гидролизат коллагена 0,5; И 880 ч 7 НО0,05; СаСОз 0,2. Холодная водопроводная вода (количество раствора) 1 л. 50Предварительную стерилизацию осуществляют доведением рН до 7,0. Продуцирующую среду инкубируют вширокогорлой колбе Эрлеймейера емкостью 250 мл при 30 - 32 С н течение3-10 дней на встряхивателе с круговойорбитой н 5,08 см со скоростью250 об/мин. Б. Ферментация А 80190 в большомобъеме. Для обеспечения большегообъема посевного материала используют 10 мл инкубиронанной среды первойстадии, полученной как это описано вразделе А, для прививки 400 мл питательной среды второй стадии, ачеющейсостав, одинаковый со средой первойстадии. Эту вегетационную среду,второй стадии инкубируют в широкогорлойколбе Эрлеймейера емкостью 2 л в течение 48 ч при 30 С на встряхивателес круговой орбитой в 5,08 дм со скоростью 250 об/мин.Полученную таким образом вегетационную среду второй стадии (800 мл)используют для прививки 100 л стерильной продуцирующей среды, получен.ной как описано н раэделе А. Продуцирующую среду подвергают дярментациив 165-литровой перемешиваемой йермен-./1 тационной цистерне в течение 8-,10 дней при температуре 30 - 32 С,Слабый поток воздуха (О;12-0,25 об/обм/мин) и низкая скорость перемешинання (150 - 200 об/мин) в перемешиваемом сосуде поддерживают уровень растворенного кислорода выше 307. насыщения воздухомП р и м е р 2. Отделение А 80190.Весь ферментационный бульон издвух 100-литроных цистерн объединяют(207 л) и фильтруют через Фильтрпресс с помощью НуЕ 1 о Бцрегсе 1. Чице-,Лиальную спекшуюся массу на фильтреэкстрагируют циркулирующач метанолом(40 л) через фильтр"пресс. Ацетонтакже может быть использован в качестве экстрагирующего вещества. Метанольный экстракт, концентрированныйпод накууммом до объема примерно .15 л, объединяют с бульонным фильтра.том (82 л). Смесь доводят до рН 9 спомощью 1 н. гидроокиси натрия, полученный раствор экстрагируют. равнымобъемом этилацетата. Этилацетатныйэкстракт концентрируют до объема примерно 700 мл. К концентрированномуэкстракту добавляют 1 л воды, рН доводят до 9,0 с помощью гидроокисинатрия, смесь экстрагируют дважды толуолом ( л), поддерживая рН при 9,0.Толуольные экстракты объединяют иконцентрируют под вакуумом, получаямаслянистый остаток, содержащийА 801 90,Остаток растворяют в толуоле15 вают, Кристаллы являются А 80190 вкислотной форме (т,пл, 115 - 120 С).П р и м е р 7, Кристаллизациянатриевой соли А 80190.Натриевую соль А 8090 (1 г) растворяют в пентане (10 мл) и оставляют,стоять при комнатной температуре втечение трех дней (растворитель выпаривают до объема смеси примерно 5 мл).30 Образующиеся кристаллы отфильтровывают и высушивают под вакуумом, получая 593 мг кристаллической натриевойсоли А 80190, т,пл, 225 - 230 С,П р и м е р 8. Получение ацетилированного А 8090.А 80190 (кислотная Форма, 200 мг)растворяют в пиридине (4 мл), добавляют уксусный ангидрид (4 мл) и смесьоставляют стоять в течение 72 ч прикомнатной температуре. Добавляют во-,ду (10 мл), водный раствор экстрагируют хлороформом (50 мл)Хлороформный экстракт промывают последовательно по 50 мл каждая 0,1 н, раствором 45 НС 1 водой, содержащей 1 Х 11 ансоз э иводой. Затеи хлороформный экстрактконцентрируют под вакуумом до получения остатка, который растворяют вацетоне (100 мл) . Ацетоновый растворконцентрируют под вакуумом, чтобыудалить остаточный пиридин и уксусную кислоту, Эту стадно повторяюттрижды, а полученный остаток растворяют в ацетоне (50 мл), Добавляют во" 55ду (50 мл) н полученный раствор оставляют стоять при комнатной температуре до завершения кристаллизации.Кристаллы отделяют Фильтрованием,промывают водой н сушат в вакуумной 1 353щую 2 л силикагеля (фирма 1 ое 1 ш, 70150 меш) в толуоле. Колонку элюнруютсначала толуолом (10 л), .а затем смесью толуол:этанол (49:1, 10 л) и(48:2, 1 О л), собирая фракции по 1 л.Элюирование контролируют биоанализоми ТСХ. фракции, содержащие А 801 90,объединяют и концентрируют. Остатокрастворяют в диоксане и высушиваютзамораживанием, получая 13,6 г сырого А 80190.П р и м е р 3. Очистка А 80190.Сырой А 80190(20,4 г ), полученныйиз четырех цистерн объемом 100 л аналогично примерам 1 и 2, растворяют вацетонитриле (200 мл), Раствор вводятв колонку, содержащую 2 л силикагеля(фирма Яое 1 в, 70 - 150 меш) и ацетонитрила, Колонку промывают аиетонитрилом (10 ли элюируют последова":тельно смесями ацетонитрнлацетона(7:3, 0 л), собирая фракции по 1 л.Элюирование контролируют биоанализом,используя Вас 11 цв вцЬСд 1 дв. Фракции,содержащие А 80190, объединяют й концентрируют, Остаток растворяют в диоксане и высушивают замораживанием,получая 15,8 г очищенного А 8090,П р и м е р 4. КристаллизацияА 80190,Очищенный А 80190 (28,2 г) раство;ряют в ацетоне (500 мл). Добавляют,воду (500 мл) и рН доводят до 5, 0 спомощью разбавленной хлористоводородной кислоты. Полученный раствор оставляют при комнатной температуре втечение 20 ч для кристаллизации.Кристаллы отделяют фильтрованием,промывают водой и высушивают в вакуумнойпечи, получая 25,9 г кристаллическогоА 80190 (кислотная форма).П р и м е р 5. Получение А 80190натрневой соли.А 801 90 (кислотная форма, 300 мг)растворяют в ацетоне (30 мл), добавляют воду (10 мл) и рН доводят до 10с помощью БаОН. Раствор концентрируют до маслянистого остатка, которыйрастворяют в диоксане и высушиваютзамораживанием, получая белый порошок (т.пл. 145 - 150 ). Мол, массапродукта по масс-спектрометрии с полевой десорбцией (ИСПД) составляет850, ИК в СНС 1 З показывает максимумыполос поглощения при следующих часто"тах, см : 2962, 2934, 2885, 2825,1719, 1569, 1455, 3397, 1377, 1358. 1861 41314,1285, 1243, 1162, 104,074,1057, 1025, 897, 979, 936, 922, 895и 847,5П р и м е р 6. Другой способ по-,лучения натриевой соли А 80190.А 80190 (кислотная форма, 5 г) растворяют в этилацетате (500 мг), добавляют воду (500 мл), Смесь доводят1 О до рН 10 с помощью 5 НаОН, перемешивая в течение 15 мин, чтобы поддерживать рН. Этилацетатную фазу отделяют,промывают водой (500 мл) и концентрируют под вакуумом досуха, Остатокрастворяют в диоксане (100 мл) и высушивают замораживанием, получая4,1 г натриевой соли А 80190. Водные промывки оставляют при комнатной температуре на ночь,а образующиеся кристаллы фильтруют и высуши 15 153 печи при 50 С, получая 192 мг кристаллического ацетилиронанного А 80 90 (т.пл. 87 - 89 С). Мол. масса равна 870 по масс-спектрометрии с быстрой атомной бомбардировкой (МСБАБ), ИК в С 1 С 1 показывает максимумы полос по 3глощения при следующих частотах,см ф;3021, 3018, 2935, 2825, 1726, 1454, 1373,131, 1244, 1162, 1104, 1078, 1058, 1025, 867, 976, 934 и 925.П р и м е р 9Получение пропионил-производного А 80190.А 80190 (кислотная форма, 200 мг) растноряют в пиридине (4 мл), добавляют пропиононый ангидрид (4 мл) и смесь оставляют стоять при комнатной температуре в течение 72 ч, Добавляют воду (10 мл) и раствор экстрагируют хлороформом (50 мл) . Хлороформный экстракт промывают последовательно по 50 мл каждая 0,1 н, раствором НС 1, водой, содержащей 17. НаНСОэ, и водой, Хпороформный экстракт концентрируют под вакуумом, чтобы получить остаток, )который растворяют в ацетоне (100 мл). Ацетоновый раствор концентрируют под вакуумом, чтобы удалить остаточные 1пиридин и уксусную кислоту. Эту ста-, дию повторяют трижды. Остаток растворяют в ацетоне (50 мл), добавляют воду (50 мл) и смесь оставляют стоять при комнатной температуре в течение 16 - 20 ч до завершения кристаллизации. Кристаллы отделяют фильтрованием, промывают нодой и высушивают вовакуумной печи при 50 С, получая 170 мг кристаллического пропионилпроиэводного А 801 90 (т.пл, 83 - 8 э С) . Мол. масса равна 884 по МСПД и МСБАБ, ИК н СНС 1 з показывает максимум полос поглощения при следующих частотах, см : 3018, 2976, 2935, 2827, 725, 1460, 1376, 1313, 160, 1105,1082, 058,1024, 987, 979, 945, 935 и 893.Ц р и м е р ы 10 - 12, Следующие сложно-эфирные производные А 80190 могут быть получены по методике примеров 8 и 9: н-гептаноильное производное А 80 90, валерил"производное А 801 90, трет-бутирил-производное А 80190.П р и м е р 13. Получение 4-бромфенилуретан-производного А 80190.А 801 90 (кислотная Форма, 7 г) растворяют в. бенэоле (100 мл) и при лев ремешивании добавляют 4-бромфенилизо иианат (3 г) н бенэоле (100 мл), Смесь перемешивают при комнатной тем 1861 6 180190.П р и м е р ы 16 - 23. Следующие уретановые.производные могут быть получены, используя методику примера 13: фенилуретан-производное 180190; 4-метилфенилуретан-производное А 801 90;4-йодфенилуретан-производное А 80190;.4-фторфенилуретан-производное А 80190; циклогексилуретан-производное А 80190;2-фенилэтилуретан-производное А 80190; 50 55 пературе в течение 168 ч. Реакциюконтролируют ежедневно ТСХ на силикагеле, используя аиетонитрил: ацетон5(1:1) в качестве проявляющего растворителя, и детектируют с помощью распылительного вещества - смесь ванилина и Н,2 ЯО,. Реакция завершается эа168 ч. Образующийся осадок отделяютО фильтрованием, а фильтрат, содержащий производное и некоторое количест.но непрореагированшего А 80190, концентрируют и лиофилизируют, получая7,5 г продукта реакции,5 Этот продукт растворяют в ацетонитриле (50 мл) и вводят в колонку,содержащую 800 мл силикагеля (фирмаИое 1 ш, 70 - 150 меш) в ацетонитриле.Колонку проянляют ацетонитрилом, со 20 ,бирая первую фракцию, имеющую объем500 мл, пять последующих фракций по100 мл каждая, а затем шесть фракцийпо 500 мл каждая. Элюирование контролируют с помощью ТСХ на силикагеле.25 Кристаллы образуются в четвертойфракции после стояния при комнатнойтемпературе в течение ночи, Кристаллы отделяют фильтрованием и высушинают под вакуумом, получая 639 мг30 4-бромфенилуретан-произнодногоА 801 90.Фильтрат высушивают, Остаток растворяют в диоксане (50 мл 1 и лиофилиэируют, получая дополнительное количество продукта (477 мг . Пятую подесятую фракции объединяют и концентрируют досуха. Остаток растворяют вацетонитриле (50 мл) и лиофилизируют,получая дополнительно 2,3аморфного 4-бромфенилуретан-проиэводногоА 80190, Это соединение имеет следующие характеристики: т.пл. 142 - 145 С,+4 С (с 1 О, СНС 1 ). Мол,масса 1025 (МСБАБ).П р и м е р ы 14 - 15, Следующиеуретановые производные А 801 90 получают, используя методику примера 13:4-хлорфенипуретан-производное А 80190и 4-нитрофенилуретан-произнодное2-фенип-циклопропилуретан-производноеА 80190; 4-феноксифенипуретан "производное А 80190.П р и м е р 24. Получение метилэфирного производного А 80190.А 80190 в кислотной форме растворяют в метаноле, добавляют воду (1/2объема), Раствор оставляют до техпор, пока не образуется эфирное производное. Раствор выпаривают под вакуумом. Продукт реакции хроматографируют, используя, например, сйликагельи получая метилэфирное производноеА 80190,П р и м е р ы 25 - 27, Используяметодику, подобную в примере 24, исоответствующий спирт ипи тиол получают следующие эфирные производныеА 80190: н -пропилэфирное производноеА 801 90; метилтиоэфирное производноеА 80190; н -бутилэфирное производноеА 80190,П р и м е р 28 . Хроматографическая идентификация А 80 90.1, ТСХ на силикагеле. Система:ацетонитрил - ацетон (1 ф 1) . М0.59.Детектирование: Васд 11 цв вцЬс 1 а.Распыление смесью ванилин - Н%.11, ЖХВП (жидкостная хроматографиявысокой производительности), Адсорбент: рВопйара 1 С(4 х 300-мм колонка), Система растворителей: ацетонитрил - тетрагидрофуран - вода (6:1:3),содержащая 17. НзРО, Доводят рН до3,0 с помощью БНАМОН. Детектирование:рефрактометр. Скорость течения3,0 мл/мии. Время удерживания 9,7 мин,П р и м е р 29, А 80190 получаютпо методике примера 1, но используяАсспошадога о 1 цоарогив ЮККЕР. 15877культуру,П р и м е р 30, Рацион цыплят,модифицированный А 80190 для борьбы скокцидиозом.В табл, 6 приведен сбалансированный, высококалорийный рацион, приспособленный к откармливаемым цыплятамдля быстрого привеса.Эти вещества смешивают в соответствии со стандартными методиками сме 1 шивания кормов, 1 ыплята, откормленные таким рационом с водой, устойчивьк кокцидиозу.П р и м е р 31. Рацион мясногоскота, улучшенный добавкой А 80190.В табл, 7 приведен сбалансированный сильно раздробленный рацион длямясного скота,Смешанный корм сжимают в кормовые гранулы. При среднеежедневной норме поглощения, равной5 Фунтов корма на животное, в корм вводят приблизительно 300 мг А 80190 (Ма-соль) на животное в день.П р н м е р 32, Рацион для свиней, улучшенный добавкой А 80190,В табл, 8 показан сбалансированный рацион для опоросных свиней,Для 200 фунтов (90,72 кг) этогорациона премнкс получают добавлением15 А 801 90 (10 г) к малому количествуэкстрагированного растворителем соевого корма. Этот премикс затсм добавляют к 200 фунтам описанного свиногорациона, смешивая стандартными способами, Этот лечебный корм обеспечиваетуровень 100 г А 801 90 на 1 т основногорациона, Лечебным кормом откармливают свиноматок в течение одного дня,предпочтительно 7 - 10 дней до опороса, введение этого корма после опороса также является желательным.Свиноматок откармливают при нормах 1, 0 - 10 г А 80190 на 100 фунтов(45,36 кг) корма, Лечебный корм пред 30 оставляется с водой, Обычно свиноматки потребляют примерно 6 - 8 фунтов(2,72 - 3,63 кг) рациона в деньП р и м е р 33. А 80190 - рецептура для поросят,А 801 90 растворяют в малом количе,стве этанола, Этот этанольный растворсуспендируется в полиэтиленгликоле200, Суспенэию концентрирует так,чтобы каждая единичная доза имелащ объем примерно 0,5 - 2 мл. Такие сус:пензии дают молодым свиньям при нор-,мах О, 5 - 50 мг на фунт три раза вдень путем принудительного откорма.П р и м е р 34, Улучшенный рацион 1,премикс) для борьбы со свинойдизентерией приведен в табл, 9.Этот премикс добавляют к обычномусвиному рациону, используя стандарт.ные методики смешивания кормов, полу 50 чая конечный уровень активного соединения 100 г/т.Показ сииергического действияА 80190 с никарбазином осуществленследующим образом: бройлерных цыплят55однонедельного возраста распределяютв клетки по пять птиц и откармливают,лечебным и контрольным рационами втечение одного дня, после чего зара.жают ооцистами, вызывающими кокциди