Способ получения солей мурамилпептидов

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУВ ЛИК а,1299516 АЗ(51)4 С 07 К 9 К 37 0 ВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР ЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ ГОСУД АРСПО ДЕЛ СРГРУЧ11 13 : ,ц ВИЯИ 9 ДЯА/82782 ро-оксифосфорилокс-) -этиламида (11), которые обладают антивирусной активностью и могут быть использованы в медицине, Для выявления активности среди замещенных пептидов были получены новые соли 1 и 11, Синтез ведут из Б-ацетил-мурамил-Ь-аланил-Р-глютаминовой кислоты или ее С(с) алкилового (С,-С ) эфира, который в среде смеси растворителей (СН С 1 + СН ОН)присутствии Б-оксисукцинимида и дициклогексилкарбодиимида конденсируют с натриевой солью Ь-аланил-(1,2- -дипальмитоил-Бп-глицеро-оксидосфорилокси)-этиламида при комнатной температуре. Испытания 1 и 11 показывают, что они обладают лучшей антивирусной активностью, чем известный Б-ацетил-мурамил-Ь-аланил-(1,2-дипальмитоил-Яп-глицеро-оксифосфорилокси)-этаноламид (пирогенность в дТ Ссоставляет 0,48-1,1 против 2). Кроме того, 1 и 11 можно использовать против вирусных и бактериальных возбудителей и для профилактики заболеваний. 4 табл.(56) Шредер ЭМир, 1967, ч,Европейсккл. С 07 С 10 ги АГ (СН Хартманн, г и Лайош 4.07(088,Любке К 1, с. 11 ий патент 3/52, опу Оскар ВакерТорчай (РЕ)) Не 025495,лик. 1981,(54) СПОСОБ ПОЛУЧ ПЕПТИДОВ(57) Изобретение пептидов, в част лей мурамилпептид милаланил-Р-г нил-( 1,2-дипалм -оксифо сфорилокс -ацетил-мурамил-(Сд.)-алкиловый -аланил-(1,2-д ЛЕИ ИУРАМИЛ НИЯ тся замещенныхнатрневых соас ост ов:1299516 17к охлажденному до -15 оС раствору20,7 г (135,77 ммоль) метилового эфира бромуксусной кислоты в 95 мл абс.тетрагидрофурана. Полученную такимобразом суспензию размешивают еще втечение 3 ч при 0-5 С, затем добавляоется 20 мл метанола и 20 мл тетрагидрофурана. С помощью 4,5 мл ледянойуксусной кислоты устанавливан т значение рН-б и раствор упаривают в вакууме при 30 оС,Остаток растворяют 200 мл метиленхлорида и промывают полученный раствор водой (Зх 125 мл), Собранные метиленхлоридные фракции высушиваютнад сульфатом натрия, фильтруют иоупаривают в вакууме при 30 С,Получают сырой продукт в виде желтоватых кристаллов, которые затемочищают хромотографией на колоннена 500 г нейтральной окиси алюминия(Йоелм Б, супер 1), используя эфирв качестве элюента (10 мл фракций).Фракции 14-36 объединяют и упариваютв вакууме.Получают метиловый эфир 1 о-бензил,6-0-изопропилиден-И-пропионил-дезметилмураминовой кислотыв виде бесцветных кристаллов с Тп121-123 (диэтилэАир".нефтяной эфир =1:2).ГсЗ = +147,9 + 0,1 С (С =(64,0 от теории),Ис;,"одный продукт получают следую 5 щим образом,Аналогично примеру 3 из 3,44 г-бутилэфир-(С)-И-оксисукцинимидэфирИ-пропионил-дезметилмурамил-Ь-аланил 5 -Р-глютаминовой кислоты в количестве5,38 г в виде бесцветных кристаллов,содержащих дициклогексилмочевину, ииспользуемых без дальнейшей очистки,ВГ = 0,61 (хлороформ:метанол:во 20 да = 70:30:5).Исходный продукт получают следующим образом,Раствор 5,1 г (7 ммоль) (Со)-трет.-бутилэфир-(С)-бензилэфира 1 Ю -0-бензил-М-пропионил-деэметилмурамил-Ь-аланил-Р-глютаминовой кислоты в00 мл смеси диметоксиэтан:вода =9:1 гидрируют с 1,5 г 5 .-ного катализатора палладий на угле (Е 10 И,30 Дегуеса) в течение 20 ч при комнатной температуре и нормальном давлении Через 20 ч катализатор отфильтровывают и снова производят гидрирование с 1,5 г свежего катализатора в35 течение 26 ч как указано. Затем катализатор отфильтровывают и Аильтратупаривают в вакууме до сухого состояния при 30 С.Полученный таким образом остаток40 растворяют в смеси, состоящей из100 мл метиленхлорида и 5 мл изопропанола, раствор смешивают с 500 млсмеси из диэтилового и петролейногоэйира = 3:2 и перемешивают еще 1 ч45 при комнатной температуре. Затем отсасывают выпавший в осадок продукти промывают его диэтиловым эАиром.Получают Ы -трет-бутилэфир И-пропионилдезметилмурамил-алканил-Р 50 -глютаминовой кислоты в виде бесцвет;ного порошка, содержащего 0,52 мольводы (3 7 г, 94,7 ,от теории).АЗ = +20,2 + 0,1 С (С = 0,902;вода);ВГ = 0,32 (хлороАорм:метанол:вода = 70:30:5);ВГ = 0,54 (ацетонитрил:вода =19 12995 Получают исходный продукт следующим образом.Аналогично примеру 4 получают из7,3 г (9,5 ммоль) (Сй)-трет.-бутилэФир-(Сь)-бензилэфирд.-О-бензил(85,3% от теории).Исходный продукт получают следующим образом.Аналогично примеру 4 из 4,65 г-1 аланил-Э-глютаминовой кислоты и2,37 г (3,1 ммоль) Ь-аланил-(1,2-дипалмитоил-Яп-глицеро-оксифосфорилокси)-этиламида получают натриевую соль Б-пропионил-дезметилмурамил-этиламид в виде бесцветного пороюка, содержащего 2,93 моль воды.Ы= +6,9 + 1 С (С = 0,504;метиленхлорид);В = 0,65 (хлороформ;метанол:вода = 70;30;5);ВГ = 0,63 (хлороформ:метанол =- 7:3), выход порошка 2,93 г (70,9%),Исходный продукт получают следующим образомАналогично примеру 4 из 2,2 г(5,8 ммоль) дициклогексилкарбодиимида и 0,69 г (5,8 ммоль) И-оксисукцинимида получают сырой (СЫ)-ь-бутилэфир-(С У)-И - оксисукцинимидэфир И-пропионил-дезметилмурамил-Ь-аланил-Э-глютаминовой кислоты в виде бесцветных кристаллов, содержащих дициклогексилмочевину и используемыхбез дополнительной очистки (количество кристаллов 3,07 г),В 1 = 0,66 (хлороформ:метанол:вода = 70;30:5).Исходный продукт получают следующим образом. Аналогично примеру 5 (продолжительность гидрирования 20 мин) из7,3 г (11,3 ммоль) (Ссдбутилэфир-(С)-бензилэфира Б-пропионил-деэметилмурамил-Ь-аланил-Р-глютаминовойкислоты получают с-д-бутилэфир Б-пропионил-дезметилмурамил-Ь-аланил-Э-глютаминовой кислоты в виде бесцветного порошка, содержащего0,88 моль воды, с выходом кислоты5,8 г(90,9 Х от теории)сю.о: +6,4 + 0,1 С (С = 0,959вода);ВГ = 0,61 (метиленхлорид:метанол::вода = О:30:5);ВГ = 0,52 (ацетонитрил:вода =- 3:1),Исходный продукт получают следующим образом.Аналогично примеру 4 из 9,5 г(13;97 ммоль) (Со)-и-бутилэфир-(СУ)-бензилзфир 4,6-0-изопропилиден-И-пропионил-дезметил-мурамилаланил-Э-глютаминовои кислоты и 120 мль603-ной уксусной кислоты получают:вода = 70:30;5),Исходный продукт получают следующим образом.Аналогично примеру 4 из 3,81 г(10,76 ммоль 7 2,72 ммоль/г, содержит еще хлорид натрия) натриевой соли 4,6-0-изопропилиден-М-пропионил-дезметилмураминовой кислоты, 2,44 г:вода = 70:30:5);БГ = 0,57 (метиленхлорид:метанол=5:1).П р и м е р 7. К раствору, состоящему из 2,85 г (2,09 ммоль) полученной согласно примеру 5 натриевой соли И-пропионил-десметилмурамил-Ь-аланил-В-глютамил-(Со)-трет.-бутилэфир-(Г )-Ь-аланин - 2-(1,2-дипалмитоил-Бп-глицеро-оксифосдюрилокси) этиламида и 112 мл абс, метиленхлорида, добавляют триАторуксуснойкислоты и все перемешивают в течение3 ч при комнатной температуре, Затембесцветный прозрачный раствор упаривают в вакууме при 30 Г и полученныйтаким образом остаток несколько развводят в метиленхлорид и снова упаривают,Получают 3,0 г бесцветного масла,растворенного в 350 мл смеси Фосфатбуферного раствора хлорида натрия(по 0,1 М, 1:1, рН = 7), фильтруютв АМ 1 СОБ-диализаторе (модель 402,ультрафильтр РМ 9 30/76 мм) при3 атм. Затем фильтруют для удаленияхлоридов в противотоке в общей сложности 2,1 л бидистиллированной воды.Раствор, оставшийся в диализаторе(приблизительно 50 мл) лиоАилизируютв высоком вакууме. Получают беспветный лиоАилизат, который очищают методом хроматограАии на колонне на260 г геля кремневой кислоты (60,0,063-0,200 мм) в системе хлороАорм: 5 ;метанол:вода = 70:30:5 (10 мл Аракцнй).Фракции 90-260 объединяют и упаривают в глубоком вакууме без нагрева (охлаждение) до сухого состояния,Остаток вводят в 250 мл бидистиллированной воды и затем в АМ 1 СОИ-диализаторе (модель 402, ультрафильтр ПМ9 30/76 мм) упаривают при 3 атм до,приблизительно 50 мл, затем последовательно Фильтруют для удаления хлоридов в противотоке 250 мл фосАатного буферного раствора - хлорид натрия (по 0,1 М 1:1, рН=7) и 175 млбидистиллированной воды. Раствор,оставшийся в диализаторе, стерильно,фильтруют, затем, пропускают черездва Фильтра с миллипорами (БАЬ ОЕИЕБ,0,45 мкм соответственно 0,2 мкм) илиофилизируют в высоком вакууме, 25Получают динатриевую соль (СМ)-1-аланин-(1,2-дипальмитоил-Яп-глицеро-оксифосАорилокси)-этиламида Б-пропионилдезметилмурамил-Ь-аланил-глютаминовой кислоты в виде бесцветного гидроскопического порошка, содержащего 48 моль воды.с 3= -6,1 + 1 С (С = 0,489; метиленхлорид:этанол = 1:1); БГ = 0,28 (уксусный эфир:л -бутанол:пиридин.уксусная кислота:вода = = 41:21:21:6:10);ВГ = 0,62 (ацетонитрил:вода = 3:1), выход соли 1,04 г (36,4 Х),П р и м е р 8, 4,5 г(ммоль) натриевой соли Б-ацетил-мурамил-Ь-аланил-Р-глютамил-(ГЫ)-трет.-бутилэфир- -(СУ)-Ь-алании-(1,2-дипалмитоил-Бп-глицеро-оксифосфорилокси)-этиламида, высушенной в высоком вакууме над пятиокисью фосфора, растворяют в 75 мл сухого дихлорметана. Охлаждают до 0 С и п помешивании в абсолютных условиях вводят 25 мл безводной триАторуксусной кислоты и затем нагревают до комнатной температуры, Через 2 1/2 ч прозрачный бесцветный раствор упаривают в роторном испарителе при комнатной температуре (приблизительно до 10 мл), многократно смешивают с дихлорметаном в коли.честве по 100 мл и наконец снова упаривают.Сырой продукт дважды очищают путем хроматографии на 400 г геля коемневой кислоты 60 (для каждого раза400 г) в системе хлороформ:метанол:;вода = 70:30:5, Продукт, содержащийся во фракциях 9-172, растворяют в100 мл дважды дистиллированной водыи чистят путем Фильтрации (АМ 1 СОИ -мешалка 402, ультрафильтр РМ10/76 мм) аналогичнЬ примеру 1, ОРаствор Фильтруют с помощью фильтрас миллипорами (0,2 мкм) и лиофилизируют, Получают:динатриевую соль (С)-) --Ь-аланин-(1,2-дипалмитоил-Бп-глицеро-оксифосфорилокси)-этиламида 5И-ацетил-мурамил-Ь-аланил-Р-глютаминовой кислоты, содержащую 4,89 мольводы, в виде бесцветного рыхлого порошка.йоЕоЗ = 10 + 1 С (С = 0,675; мета нол), выход соли 1,1 г (253);ВГ = 0,08 (хлороформ:метанол:вода = 70:30:5);ВГ = 0,15 (этиловый эфир уксуснойкислоты:и-бутанол:пиридин;уксуснаякислота;вода = 42:21:21:6:10);ВГ = 0,30 (хлороформ:метанол:вода::уксусная кислота = 70:40:9:1),Проведены биологические испытанияполученных предложенным способом солей мурамилпептидов.Альвеолярные макрофаги крыс, полученные при промывке легких, инкубируют 24 ч либо с липосомами, включающими активное вещество, либо в Физиологическом растворе с активным веществом. Вводят опухолевые клетки, мараькированные 1, Инкубируют 72 чПогибшие опухолевые клетки отмывают,определяют число живых клеток по их 40радиоактивности. Активность макрофагов оценивают на основе клеточнойтоксичности, т.е, по числу животных,погибших при опытах. Удельная клеточная токсичность (7) рассчитываласьследующим образом: срм в опухолевых клетках, инкубированных макрофаги активным началом50срм в опухолевых клетках, инкубированных макрофаги и РВБОпыты проведены со следующими соединениями:1 - натриевая соль И-ацетил-мурамил-Ь-аланил-Э-глютамил в (СР)-1-аланил-(1,2-дипалмитоил-Бп-глииеро-оксифосфорилокси)-этиламида;-глютамил (Сд,бутиловый эфир - ( С У) -Ь-иланил- ( 1 2- -дипальмитоил-Бп-глицеро- -3-оксифосфорилокси)-этиламида, (пример 5);натриевая соль И-пропионил- -нормурамил-Ь-аланил-Р- -глютамил (Сс)-л-метилэфир- -(С У)-Ь-аланил - 2-(1,2-дипальмитоил-Бп-глицеро- -оксифосфорилокси)-этиламида (пример 4);натриевая соль И-ацетил- -мурамил-Ь-аланил-Э-глютамил-(Сс)-трет.-бутилэфир -(Гг)-Ь-алании-(1,2-дипальмитоил-Бп-глицеро. - -оксифосфорилокси)-этиламида (пример 3);натриевая соль И-ацетил -мурамил-Ь-аланил-Р-глютамил-(СКметиловый сложный эфир (С г)-1 алании-(1,2- -дипальмитоил-Бп-глицеро- -3-оксифосфорилокси)-этиламида (пример 2);натриевая соль И-пропионил-нормурамил-Ь-аланил-Т)- -глютамил-(СЫ) в сложн трет.-бутиловый эФир-(С) - -алании-(1,2-дипальмиттоил-Бп-глицеро-оксифосфорилокси)-этиламида (пример 6).ные результаты сведены в Т.Т 1 Ч -Ч 1 Получентабл, 1. Проведено сравнение производных мурамилпептидов обшей Формулы 1 с известным соединением.Испытание на пирогенность проведено на кроликах и показало, что при подкожном введении высоких доз, как 30 мг/кг И-ацетил-мурамил-Ь-аланил- -1)-глютамил-(Сс)-ь-бтилэфир-(С г)-1 -алании-(1,2-дипальмитоил-Бп-глицеро-оксифосфорилокси)-этиламид-соль натрия (соединение 11) не наблюдается пирогенного эффекта.В противоположность этому при тех же дозах натриевой соли М-ацетил-мурамил-Ь-аланилв изоглютамин-Ь- -алании-(1,2-дипалмитоил-Бп-глицеро-оксифосфорилокси)-этиламида (Ч 11) наблюдается сильное повышение температуры.Результаты испытания на пирогенность при внутривенном введении испытуемых соединений в дозе 1 мг/кгпоказаны в табл. 2,Результаты показывают, что изменение температуры ( ьТ )С) в случаепредложенных соединений примерно в2-4 раза ниже, чем в случае известного соединения )/П . Кроме того, мурамилпептиды формулы 1 могут успешноприменяться для профилактики и лечения заболеваний, вызываемых ДНК - вирусами с кубической симметрией и нуклеокапсидом без оболочки, ДНК - вирусами с вирионом в оболочке, а также РНК - вирусами с кубической симметрией капсида и РНК - вирусами соспиральной симметрией капсида,Соединения формулы 1 предпочтительно использовать в случае ДНКвирусов с вирионом в оболочке и кубической симметрией капсида, в случаеРНК-вирусов с кубической симметриейкапсида и варионом без оболочки, атакже в случае РНК-вирусов со спиральной симметрией капсида, в которыхнуклеокапсидная оболочка расположенау наружной поверхности мембраны, и,кроме того, в случае АйепотгЫае,е, 30РохчхгЫез, СогопагЫае, в частности, при человеческих Согопагеп.В первую очередь соединения йормулы 1 применяют в случае Негрезчхгйае, рсогпачгЫае, Мухочхгеп, атакже в случае шаз 1 айепчгеп, в частности человеческих заболеваний, причем сильное действие проявляется нетолько в случае бактериальных возбудителей, но и против вирусных воз-будителей, Эти соединения проявляютдлительное профилактическое или терапевтическое действие, длящееся отмногих дней до нескольких недель после однократного приема соединенийформулы 1, получаемых предложеннымспособом, а такхе эффективное воздействие на широкий спектр вирусныхвозбудителей.Проведены испытания антивируснойактивности предложенных соединений.А = натриевая соль И-ацетилмурамил-Ь-аланил-Э-глютаминовой кислоты-(СУ)-Ь-аланил-(1,2-дипальмитоил-сн-глицеро-оксифосфорилокси)-:55-этиламид.В = натриевая соль И-ацетилмурамил-Ь-аланил-Э-глютамил-(Сф- -бутиловый сложный эфир-(Сб)-Ь-аланин-(1,2-дипальмитоил-сн-глицеро- -оксифосйорилокси)-этиламид.С = натриевая соль И-ацетилмурамил-Ь-аланил)-глютамил-(СУ)-метиловый сложный эфир-(Сй)-Ь-аланин- (1,2-дипальмитоил-сн-глицеро-З-оксифосйорилокси)-этиламид. Каждую из 20 и 30 самок мышей - МРГ ЯРЕ ве)сом каждая по 14-16 г заражают черезнос, применяя легкую анастезию и используя смесь из равных частей диэтилового эфира, этанола и хлороформа, образующих пластинки единицамивирусовых штамов 1 пГ 1 пепка А(Уехав)1/77 (адаптирующихся мышами) в количестве 1-4 в виде 0,05 мл взвеси вирусов,В указанный срок для заражения ворганизм каждой их мышей вводят единожды (единичная доза) согласнотабл, 1 количество активного ингредиента в 0,2 мл 0,005 -ного по весураствора натрий-карбоксиметилцеллюлозы в дважды дистиллированной воде через нос или через рот,Остальные из числа укаэанных мышей, т.е. 10 или 20 животных служатв качестве контрольных; им вводятплацебо (0,005 .-ный по массе растворнатрий-карбоксиметилцеллюлозы).Через нос активный ингредиент вводят, применяя легкую анестезию с использованием смеси из равных частейдиэтилового эфира, этанола и хлороформа.Процентное количество мьппей, оставшихся в живых через 24 дн, послезаражения, приведено в табл. 3. Проведено сравнение с известным антивирусным агентом (действует на вирусы ХпГ 1 цепка А) - амантадином. Действие амантадина начинается только при дозе в несколько мг/кг, значение ЛД для мышей составляет 700 мг/кг.Предложенное соединения действуют уже при дозе О,1 мг/кг, в определенных случаях уже при 0,01 мг/кг, в то время как значения для мьыей составляет более 3000 мг/кг, Это зна. - , чит, что диапазон терапевтического действия предложенных соединений по сравнению с амантадином значительно шире. К тому же, предложенные соединения проявляют антивирусное действие уже после их однократного применения не более чем за 7 дн, до зара129951 6 30Таблица 1 Удельная клеточная токсичность, 3 Активное вещество Активное вещество в 100 мглипосомы на 0,2 мл, мг/культура 0,2 мл РВ активного ещества, мг/культу ра+2,0 Известное Ч 11 Таблица 3 Активниигреди Процентное кол-во мышей, оставшихся в живых после заражения и обработанных количеством аКтивного ингредиента, мг/кг (и.С - иоС СевСей - испытания не проводи- лись ремя ввоа (кол-воней) ид ввода еред зараением. после заражения) 0-контроль31 32Продолжение табл, 3 1299516 Активы Вид вводаингреднент 1 0-контроль 0,01 100 10 1 0,1 Через нос п.С п.С 80 60 90 10 Через нос п.С 70 90 20 10+7 Оральный 20 В Оральный 70 40 20 50 40 50 30 20 п,С Через нос 0 п.С Ораль ный 15 Оральный 0 Через нос Через нос п,С п.С 70 50 и С и С 50 50 50 1 О 50 10 Таблица 4 Испытуемое соединение ЛД , мг/кг 3150 3460 3380 1 Ч 3110 3420 Ч 1 ВНИИПИ Заказ 906/64 Тираж 348 Подписное Произв.-полигр. пр-тие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Время ввода (кол-водней)перед заражениемпосле заракения) Процентное кол-во мышей, оставшихся в живых после заражения и обработанных количеством активного ингредиента, мг/кг (и.С - поС СезСей - испытания не проводи- лись 80 30 80 п.С п.С 60 40 70 п.С п,Сп.С п.С 40 55 30129 Изобретение относится к способу получения солей мурамилпептидов - новых биологических активных соединений, которые могут найти применение в медицине.Цель изобретения - получение новых производных в ряду мурамилпептидов, обладающих более высокой антивирусной активностью и низкой токсичностью.П р и м е р 1. 3,60 г(5,66 моль) (СЫ)-п-бутилового эфира Б-ацетилмурамил-Ь-аланил-Р-глютаминовой кислоты, 0,6 моль воды и 0,88 г(7,54 ммоль) Б-оксисукцинимида при непрерывном перемешивании растворяют в 20 мл смеси хлороформа и метанола при объемном соотношении 4:1, В смесь вводят 1,6 г (7,54 ммоль) твердого дициклогексилкарбодиимида и по каплям в течение 4 ч при комнатной температуре добавляют раствор 3,7 (4,72 ммоль) натри- евой соли Ь аланил-(1,2-дипальмитоил-глицеро-оксифосфорил-окси)-этил-амида в 40 мл хлороформа. Смесь выдерживают 1 ч, упаривают на роторном иапарителе, к остатку добавляют 200 мл диоксана, раствор лиофилизуют.Продукт суспендируют в 100 мл хлороформа, добавляют 600 мл эфира уксусной кислоты, смесь при непрерывном перемешивании охлаждают в ледяной бане в течение 1 ч, Нерастворившиеся частичци дициклогексилкарбодиимида отфильтровывают, Фильтрат упаривают, Остаток растворяют в 14 мл смеси хлороформа-метанола и воды 70:30:5 (объемное соотношение) и очищают на колонке (диаметр 4,5 см, длина 80 си) заполненную 700 г геля кремневой кис - лоты 60 (Мерк, 70-230 Меш, АБО) в указанной смесирастворителей. Прого,няют 500 мл указанной смеси, затем этой же смесью элюируют продукт. собиоая фракции объемом 10 мл У 133-152 и 153- 236, их раздельно подвергают диофильтрации. Процент основной Фракции растворяют в 300 мл бидистиллированнойо воды, быстро нагревают до 40 С, после охлаждения пентрифугируют, удаляя нерастворившиеся частички дициклогексилмочевины.Надосадочную жидкость подают в диализатор ( Амикон Корпорейшн, Данвер, Массачуает, 01932 С 111 А, модель ЦО 2, ультрафильтр РМ, 10176 мм диаметр, инертный, неонный полимер на основе полисульфона, средняя не 9516 2личина пор 10 А) и. подвергают диализу при 4 атм техн, против 1,5 л бидистиллированной воды, 0,5 л буферного раствора ФосфаТа-хлорида нат 5 рия (по О,1 М, 1:1, рН = 7) и 1,5 лводы полного вымывания хлоридов,Полученный продукт диализа ( 70 мл)стерильно фильтруют на фильтре смилипорами (0,2 мкм) и лиофилизируют.,Получают натриевую соль И-ацетил-мурамил-Ь-аланил-Р-глютамил-(Сд)- -н-бутилэфир-(Сг)-Ь-алании-(1,2-дипалмитоил-Яп-глицеро-окси-ФосФорилокси)-этиламида (3,4 моль Н О)2в виде бесцветного порошка в количестве 4,13 г (67 от теории):: + 14 + 1 С (С = 0,44;Эвода);ВГ = 0,37 (хлороформ:метанол:во 20да = 70 : 30 : 5);БГ = 0,64 (этиловый эфир уксуснойкислоты : н-бутанол-пиридин:уксуснаякислота:вода = 42:21:21:6:10)Рассчитано,: С 54,77; Н 8,94;М 5,07; Р 2,24; Н О 4,71СвН О,о ИРЛа3,41 НО(1381,63)Найдено,: С 54,3; Н 9,1; Б 5,6;Р 2 3 Н О 4,7,Рассчитано: Иа 1,75СН, О,Б РБа (13 6,59)Найдено,", Иа 1,57.Исходный продукт получают следующим образом.5,5 г (8,1 ммоль) (С)-и-бутил-(С)- бензилэфир,6-0-изопропилиден-И-ацетил-мурамил-Ь-аланил-Р-глютаминовой кислоты растворяют в 60 мл60 -ной уксусной кислоты и оставляютна ночь при комнатной температуре.40Желтоватый раствор выпаривают прибли. зительно наполовину на роторном ис-,парителе при 30 С, лиофилизуют,4,8 г (7,5 ммоль) полученногопродукта растворяют в 100 мл смеси45диметоксиэтана и воды (9:1), смешивают с 0,8 г катализатора, состоящего из окиси палладия на угле(10 -ный) и в течение 4 ч обрабатывают водородом, катализатор отфиль 50тровывают, Фильтрат упаривают, остаток чистят дважды хроматографиейна геле кремневой кислоты 60 (Мерк,1:200, Фракции 10 и 5 мл) в системехлороформ; метанол: вода 70:30:5.55Фракции, содержашие продукт, объединяют, упаривают,Полученный продукт частично представленный в виде натриевой соли(из геля кремневой кислоты) растворяют в 40 мл бидистиллата и пропускаютчерез 50 мл хорошо очищенного ионообменника (Вочех 5 Ь х 8 50/100 меш,форма Н) колонку промывают 100 млбидистиллата, элюат фильтруют черезфильтр с миллипорами 0,2 МкМ и лиофилизуют. Получают 3,7 г (693 оттеории) (Сс 1)-и-утиленэфира-И-ацетил-мурамилаланил 0-глютаминовой 10кислоты в виде бесцветного порошка,содержащего 0,6 моль воды.1 д 3 +45 + 1 С (С = 1,142, мета.рнол);ВГ 0,23 (хлороформ:метанол:вода 1570:30:5);ВГ 0,40 (Н-бутанол:уксусная кислота:вода 75:7,5:21),Исходный материал получают следующим образом. 204,4 г (11 ммоль) натриевой солиБ-ацетил,6-0-изопропилиден-мурамиловой кислоты (2,5 моль, 1 г) суспендируют в 60 мл диметилформамида.При интенсивном перемешивании последовательно добавляют 4,4 г (11 моль)хлоргидрата (Сс)-и-бутиловый эфир-(Сд.)-бензиловый эфир Ь-аланил-Р-глютаминовой кислоты, 2,53 г (22 ммольБ-оксисукцинимида и 2,5 г (12,1 ммоль)30дициклогексилкарбодиимида, смесь перемешивают в течение ночи при комнатной температуре.Для переработки суспензии последнюю разбавляют 100 мл этилового эфира уксусной кислоты и после получаосового размешивания при О Г отфильтровывают нерастворившиеся частички(дициклогексамочевина, хлорид натрия).Фильтрат упаривают в вакууме при30 С, остаток вводят в 400 мл уксусного эфира и экстрагируют бидитиллированной водой (10 х 50 мл). Послесушки органической фазы и упариваниярастворителя остается 5,6 г (СК)-и 45-бутилэфира-(Со)-бензилэфира Б-ацетил,6,0-изопрополиден-Ь-аланил-Р. -глютаминовой кислоты в виде аморфного порошка (75 Я от теории)./Ы( -- +30 + 1 С (С = 0,732; метанол);БГ = 0,87 (хлороформ:метанол:вода = 70:30:5); ВГ = .0,83 (ь -бутанол:уксусная кис 55лота:вода 75:7,5:21).Исходный продукт получают следующим образом. 16 45,6 г (12,1 ммоль) (СФ)-о-бутилэфир-(Г 7)-бензилэфира Б-третичн. бутилоксикарбонил-Ь-аланил-В-глютаминовой кислоты растворяют в 20 мл абс.этилэфира уксусной кислоты, при интенсивном перемешивании и исключениипопадания влаги по каплям . вводят50 мл 4,5 н. соляной кислоты в абс.уксусном эфире и смесь оставляютостоять в течение часа при 0 С. Желтоватый раствор упаривают при комнатной температуре приблизительно до20 мл, смешивают с 150 мл диоксана илиофилизируют, Получают 4,75 г (973от теории) гидрохлорида (СФ)-и-бутилэфир-(Сг)-бензилэфир-Ь-аланил-Р-глютаминовой кислоты в виде бесцветного маслаГ д 3, = +19 + 1 С (С = 0,313; метанол);ВГ = 0,58 (хлороформ:метанол:вода = 70:30:5);ВГ = 0,56 (этил-эфир уксуснойкислоты: и -бутанол:пиридин:вода == 42:21:6:10),Исходный продукт получают следующим образом.К 8,5 г (25,8 ммоль) гидрохлорида(25,8 ммоль) И-трет.бутилоксикарбонил-Ь-алании-И-оксисукцинимидэфира.растворенных в 150 мл диметилформамида, добавляют 2,6 г (25,7 ммоль) Бметилморфолина и смесь оставляютстоять в течение 20 ч при комнатнойтемпературе, Прозрачный желтый растовор выпаривают в вакууме при 30 С,полутвердый остаток вводят в 500 млэтилового эфира уксусной кислоты иэкстрагируют семь раз безводнымсульфатом натрия. Остаток после выпаривания уксусного эфира чистят на600 г геля кремневой кислоты 60(Мерк, размер зерна 70-230, меш АЗАМ)в системе хлороформ:метанол = 98:2.Продукт в фракциях 36-82 собираюти высушивают, Получают (Со)- -бутилэфир-(СУ)-бензилэфир-И-трет.-бутилоксикарбонил-Ь-аланин-В-глютаминовойкислоты в виде бесцветного масла5 12Исходный продукт получают следующим образом.К 1.,0 г (30 ммоль) (СЫ)-и-бутилэфир-(СУ)-бензилэфира И-трет.-бутилоксикарбонил-Р-глютаминовой кислоты, растворенного в 25 мл абс, этилового эфира уксусной кислоты, добавляют на холоде при постоянном помешивании и исключении попадания влаги 25 мл 4 н.соляной кислоты в абс. этиловом эфире уксусной кислоты и оставляют все это стоять в течение часа. Легколетучие составляющие упаривают при 25 С, масляный остаток вводят в 150 мл абс. диэтилового эфира и смесь упаривают снова (3 мл). Масляный остаток высушивают над натровым асбестом при полувакууме. Получают гидрохлорид (СЫ) - и-бутиловый эфир-(СУ) - -бензилового эфира Э-глютаминовой кислоты (8,5 г; 92,4 Е от теории).(с 3 = 9 + 1 С (С = 0,646; меЭтанол);ВГ = 0,82 (хлороформ:метанол:вода = 70:30:5);ВГ = 0,68 (этил-эфир уксусной кислоты и-бутанол:пиридин:уксусная кислота:вода = 42 21:21:6:10).Исходный продукт получают .следующим образом.20,0 г (64,6 ммоль) (СУ)-бензилового эфира Б-трет.-бутилоксикарбонил- -Э-глютаминовой кислоты растворяют в 750 мл абс,тетрагидрофурана, 25,05 г (64,6 ммоль) карбоната цезия (флука, чистый), растворенных в 80 мл воды вводят по каплям и всю смесь уларивают в вакууме, Остаток растворяют в 200 мл абс.диметилформамида, растворитель упаривают и всю операцию повторяют, Кристаллический остаток, полученный после сушки в высоком вакууме, растворяют в 1 л абс. диметилформамида и при постоянном перемешивании по каплям вводят 13,3 г (97 ммоль) и -бутилбромида.Суспензию, полученную после 18-ча сового перемешивания при комнатной температуре, фильтруют, фильтрат упаривают наполовину и после добавления 1 л этилового эфира уксусной кислоты экстрагируют водой (10 х 100 мл). Органическую фазу сушат над сульфатом натрия и упаривают, Масляный остаток вводят в 100 мл диэтилового эфира и кристаллизуют благодаря добавке 1800 мл петролейного эфира и выдерж- ке при -1 О С, Кристаллическую массу 99516отсасывают, промывают и высушивают.Получают (СЫ) - и-бутилэфир-(Сй)-бензилэфир 11-трет,-бутилоксикарбонил-П-глютаминовой кислоты в виде бесцвет 5 ных игл (21 г; 89 от теории),Т = 70-71 С;о 3 = 20+1 С (С = 1,149, металнол);ВГ = 0,77 (хлороформ:изопропанол:10 ;уксусная кислота = 30:8:2);В = 0,92 (этил-эфир уксуснойкислоты:и;-бутанол:пиридин:уксуснаякислота:вода = 42:21:21:6:10).Ь-алании-(1,2-дипалмитоил-Бп-глицеро-.3-оксифосфорилокси)-этиламид, служащий в качестве исходногопродукта, получают следующим образом.13,25 г (14,9.ммоль) Б-трет.-бутилоксикарбонил-Ь-аланин-(1,2-ди 20 палмитоил-Бг;глицеро-оксифосфорилокси)-этил-амид вводят при постоянном перемешивании вводят в 170 млохлажденного до 0 С смеси из трифторуксусной кислоты и хлористогометилена при соотношении 1:3 (7:Ч),причем получают прозрачный раствор.После выдержки в течение 2 1/2 чпри комнатной температуре растворупаривают на роторном испарителепри 30 С. Полутвердый остаток дляудаления избыточной трифторуксуснойкислоты смешивают неоднократно каждый раз со 100 мл хлорида метиленаи затем выпаривают,35 После пятикратного перетиранияостатка каждый раз со 100 мл абс.диэтилового эфира и отстаивания полученного продукта получают хорошофцльтруемую суспензию. Ее Фильтруют40 на нутч-фильтре, промывают твердыйпродукт диэтиловым эфиром, затемдважды каждый раз 100 мл горячегоацетона и сушат в вакууме при 60 ОС. Получают 10,9 г Ь-алании-(1,2-дипальмитоил-Бп-глицеро-оксифосфорилокси)-этиламид в виде бесцветных кристаллов с Т= 138-147 С(95,67, от теории),д.3 = +30 + 1 С (С = 1, хлоро-.Форм:метанол:вода = 70:30:5); ВГ = 0,14 (хлороформ:метанол =7:3);ВГ = 0,40 (хлороформ:метанол:вода = 70:30:5).Полученный таким образом продукт переводят в натриевую соль следующим образом, 7 1299516 83,82 г (5 ммоль) Ь-аланин-(1,2- ный раствор упаривают на роторном-дипальмитоил-Яп-глицеро-оксифосфо- испарителе до сухого состояния ( 30 С),рилокси)-этиламида растворяют в Полученный продукт очищают на геле100 мл смеси хлороформ:метанол = 7:3 кремневой кислоты 60 (Мерк, размерпри кратковременном нагревании до 5 зерен 70-230 Меш, АЯЗОМ) в системе35 С. Охлаждают и осторожно добавля- хлороформ;метанол:вода = 70:30:5ют по каплям 5 мл 1 Б натрового щело- (5 мл фракций). Фракции содержащиека. Прозрачный раствор выпаривают продукт, собирают (ДС). Остаток посприблизительно до 1/З.первоначально- ле выпаривания растворителя растворяго объема и после добавления 200 мл Ю ют в 250 мл дважды дистиллированнойдиоксана лиофилизируют. Получают нат- воды и очищают аналогично тому, какриевую соль Ь-алании-(1,2-дипальми- это описано в примере 1, путем дитоил-Яп-глиперо-оксифосфорилокси)- фильтрации (АМ 1 СОИ-мешалка, тип 402,-этиламида в виде рыхлого порошка ультрафильтр 9.30/76 мм). Раствор,-(СЫ)-метилового эфира Б-ацетил-му- лиофилизируют, Получают натриевуюрамилэтенил-Э-глутаминовой кисло- , соль Б-апетил-мурамил-Ь-аланилты и 1,2 г М-оксисукцинимида раство- -глютамид-(СЫ)-метилэфир-(С)-1-аларяют в 50 мл смеси, состоящей.из ди нин-(1,2-дипальмитоил-Яп-глицерометилформамида, изопропанола и хлоро- -З-оксифосфорилокси)-этил-амида,форма (1:3:6; 7;Ч;Ч), добавляют 2,96 моль Н О в виде бесцветного по 2,10 г (10,35 ммоль) дициклогексил- рошка.2 Оокарбодиимида и при исключении попада- с 1 = +11 + 1 С (С = 0,285;3ния влаги при помешивании выдерживают 25 10 - ная уксусная кислота);1 ч при комнатной температуре. Сус- ВГ = 0,25 (хлороформ:метанол:вопензию смешивают с 50 мл этилового да = 70:30:5.);эфира уксусной кислоты, 30 мин выдер- ВГ = 0,39 (этиловый эфир уксуснойживают при перемешивании в ледяной кислоты: и -бутанол-пиридин:уксуснаяванне.и затем отфильтровывают нерасткислота:вода = 42:21:21:6:10) (вворимые частицы дициклогексилмочеви- кол-ве 3,1 г; 55 . от теории),ны. Фильтрат упаривают на роторном Исходные соединения получают. слеиспарителе приблизительно до 40 мл, дуюшим образом,в результате добавления 150 абс, ди,7 г (21,2 ммоль) гидрохлоридаэтилового эфира выпадает сложный 35 (СЫ)-метилэфира-(С г)-бензилэфираактивный эфир (дважды), фильтруют и 1 аланил-Р-глютаминовой кислоты ивысушивают, в результате получают 8,96 г (23,3 ммоль) натриевой солиэфир с Б-окси-сукцинимидом с ВГ = И-ацетил,6-0-изопропилиден-мурами= 0,43 (хлороформ;метанол;вода = новой кислоты соединяют аналогично70;30:5) - сырьевой продукт в ко примеру 1 по методу дициклогексикарличестве 5,1 .г, бодиимид): Б-о к си-сук синимид, Полу 3,43 г (4,4 ммоль) 1 алании- ченный продукт без дальнейшей очист-(1,2-дипалмитоил-Яп-глицеро-З-окси- ки расщепляют в 100 мл 60 -ной укфосфорилокси)-этиламида суспендируют сусной кислоты. После 5 1/2 ч мешаов 45 мл хлороформа и при 40 С в те ния при комнатной температуре растчение 5 мин по каплям вводят 0,86 мл вор упаривают, смешивают с водой,. ного в 5 мл хлороформа, при этом по мл диоксана лиофилизируют. Осталлучают прозрачный раствор. К немУ по ток чистят на 60 мл геля кремневойкаплям при интенсивном мешании б 0 кислоты в системе хлороформ:метанол:при исключении попадания влаги .:вода = 70:30:5 (7 мл фракций), пров течение 5 мин добавляют раствор цесс проводится дважды.указанного активного сложного эфира Фракции, содержание необходимыйв 100 мл смеси, состоящей из диметил- продукт, объединяют, растворительформамида, хлороформа и диоксана 55 упаривают. В остатке (Сс)-метилэфир(1:14:6; 7:7 Л). (С 1)-бензилэфир И-ацетил-мурамил-ЬПосле 2 1/2 ч перемешивания при -аланил-Э-глютаминовой кислоты в викомнатной температуре несколько мут- де бесцветной пены с БГ = 0,63 хло 9 12995роформ:метанол:вода = 70:30:5) в количестве 6,9 г.6,0 г (10 ммоль) (Сс-метилэфир-(СУ)-бензилэфир Б-ацетил-мурамил-Ь-аланил-Р-глютаминовой кислоты, растворенного в смеси 1,2 диметоксиэтана и воды 95,5 (Ч:Ч), гидрируют вприсутствии 0,6 г катализатора палладий на угле (10 .-ный) в течение 11/2 ч при нормальном давлении. Ката Олизатор отфильтровывают и фильтратупаривают при комнатной температурепри повьппенном давлении. Остаток чистят на 400 г геля кремневой кислоты60 в системе хлороформ:метанол:вода= 15- 70:30:5 (10 мл Фракций), как былоуказано вьппе,Фракции, содержащие продукт объединяют, растворитель упаривают, Остаток в форме соли натрия чистят от 20солей, как описано в примере 1, на50 мл Рочех 50 4 Х 8 (50/100 Меш,Форма Н, сильнокислотный катионообменник). Фильтрат пропускают черезФильтр с миллипорами (0,45 мкм) илиофилизируют. Получают (СЫ)-метиловый эфир Б-ацетил-мурамил-Ь-аланил-Р-глютаминовой кислоты (1,27 мольН О) в виде бесцветного порошка ссг.Д = +47 + 1 С (С = 1,249; метанол) в количестве 3,1 г (58 от теории).ВГ = 0;80 (хлороформ:метанол:вода = 70:30:5);ВГ = 0,30 (ацетоннитрил:вода = 353:1);ВГ = 0,43 (этиловый эфир уксуснойкйслоты:уксусная кислота:вода:метанол = 67:10:23:12),П р и м е р 3, 9,4 г (11,1 ммоль)40(Сс)-Фрет.-бутилэфира И-ацетил-мурамил-Ь-аланил-Р-глютаминовой кислотыпереводят аналогично примеру 2 в активный эфир и затем, как описано.соединяют с 6,48 г (8,2 ммолв) Ь-алании-(1,2-дипалмитоил-Бп-глицеро-оксифосфорилокси)-этиламида вприсутствии триэтиламина. Полученныйпродукт суспендируют в 250 мл бидистиллата воды и быстро нагревают до 5037 С, перемешивают 15 мин в ледянойванне, отфильтровывают нерастворимыечастички дициклогексилмочевины ифильтрат подвергают диафильтрации,как описано в ггримере 1 (АМ 1 СОМ - ме шалка 402, ультрафильтр РМ 0 30/76 ммОстающийся в мешалке раствор (120 мл)лиофилизируют и продукт чистят на 16 1 Охроматографе на 550 г геля кремневой кислоты 60Получаемьпг продукт собирают, смешивают с 200 мл бидистиллированной воды (рН=7), фильтруют в стерильных условиях (0,45 мкм) и лиофилизируют, Получают натриевую соль Б-ацетил-мурамил-Ь-аланил-Р-глютамил-(Со(:)-трет-бутилэфир-(С)-Ь-алании-(1,2-дипалмитоил-Бп-глицеро-оксифосфорилокси)-этил-амида в виде бесцветного поронка, содержащего 3,4 моль воды.сг.3 . +14 + 1 С (С = 0,817; .1 О -ная уксусная кислота); ВГ = 0,29 (хлороформ:метанол;вода = 70:30,",5);ВГ = 0,53 (этиловый эфир уксусной кислоты: Л -бутанол:пиридин:уксусная кислота:вода = 42:21:21:6:О). Выход натриевой соли 8,39 г 78 . от теории, Пептидпроизводное, используемое в качестве исходного продукта, получают следующим образом.38,3 г (63,5 ммоль) (Сог)-трет, - -бутилэфир-(Сг)-бензилэфира И-(4- -бифенилил)-пропилоксикарбонил 1-Ь- -аланил-Р-глютаминовой кислоты растворяют в 700 м смеси из трифторэтана и воды = 9:1 (Ч/Ч) и в результате добавления по каплям 1,23 н.соляной кислоты в такой же смеси растворителей (1 об, ч, концентрированной соляной кислоты и 9 об. ч. трифторэтанола) значение рН уменьшается до 1,5 (2 1/2 ч, расход 51,66 мл, т,е, 81% от теории).Светложелтоватый раствор на роторном испарителе в вакууме, создаваемом водоструйным насосом, при 30 С упаривают почти до 100 мл, затем добавляют 200 мл диоксана, смесь высушивают на холоде.Полутвердый остаток растворяют в 30 мл абс, диэтилового эфира и при 0-5 С при постоянном перемешивании, и продукт осаждают 150 мл петролейного. эфира. Выдерживают на холоде (-20 С), декантируют и повторяют эту процедуру дважды. Масляный остаток затем вводят в 100 мл, трет,-бутанола, лиофилизируют и остаток высушивают над натровым асбестом в высоком вакууме, Получают гидрохлорид (СоЦ-трет,-бутилэфира (СУ)-бензилэфира Ь-аланил-Р-глютаминовой кислоты в виде сильно гиг роскопичного порошка.(4-бифенилил)-пропилокси-карбонил 3-Ь-аланина в 650 мл абс. диметилформамида, добавляют при постоянном помешивании 22 мл (0,24 моль) Б-метилформалина и затем 59,11 г ( 0,24 моль)2-этокси-Б-этокси-карбонил,2-дигид, рохинолина. После 10-часового размешивания при комнатной температурежелтый раствор упаривают на роторномиспарителе при 30 С, Остаток вводятв 1 л этилового эфира уксусной кислоты, экстрагируют водой (5 х 200 мл),водную фазу экстрагируют 0,5 л уксусного -эфира и собранные органическиеЛазы высушивают.Продукт, полученный после упариваниярастворителя (продукта 150 мл)чистят многократно на хроматографена геле кремневой кислоты 60 (1:20)с уксусным эфиром. Получают (Сс 4- -трет.-бутилэфир-(С)-бензилэфир-И-(4-бифенилил)-пропилоксикарбонил-Ь-аланил-Р-глютаминовой кислоты ввиде бесцветного масла.о 3 = -14 + 1 ОС (С = 1,625; этиЭловый эфир уксусной кислоты) (100 г,832 от теории);В 1 = 0,73 (хлороформ:изопропанол:= 1:1).Используемый в качестве исходногопродукта гидрохлорид (СЫ)-трет,-бутилэфира-(СУ)-бензилэфира Р-глютаминовой кислоты получают путем проведения реакции между (С)-бензиловымэфиром Э-глютаминовой кислоты и изобутанолом в смеси, состоящей из 1,4-диоксана и серной кислоты, выделяютпродукт в виде бесцветных игл с Т- 108-109 С,:изопропанол:вода = 70:30:2 при помешивании при 15 фС в течение 1 О минпо каплям добавляют 14,52 г(7,26 ммоль) (Со)-метилэфир-(СУ)-Б-гидрооксисуксинимидэфира Б-пропионил-дезметилмурамилаланил-Э-глю-таминовой кислоты, содержащий еще дициклогексилмочевину, причем раствормутнеет на глазах.Затем после 15-минутного помешивания при 15 С охлаждение прекращаюти продолжают перемешивание еще 21/2 ч при комнатной температуре. Затем полученный таким образом мутныйраствор упаривают в вакууме при 30 С.30Остаток (10,75 г) суспендируют в170 мл бидистиллированной воды(рН = 5,5), суспензию путем добавки0,3 мл триэтиламина доводят до рН- 6,0; отфильтровывают нерастворимыечастицы (дициклогексилмочевины) иЗ 5 фильтрат лиофилизируют в высоком вакууме.Полученный таким образом лиофилизат растворяют в 300 мл, затем лио 40филизируют в глубоком вакууме.Получают натриевую соль Б-пропио- нил-дезметилмурамил-Ь-аланил-П-глютамил-(Сс)-метилэфир-(Сф)-Ь-аланин-(1,2-дипалмитоил-Гп-глицеро-З-ок 45сифосфорилокси)-этиламида в видебесцветного порошка, содержащего1,90 моль воды.д до 3 7 + 0,1 С (С = 0,672;хлороформ);д.: +1,7 + 0,1 С (С - 1,044,вода);ВГ = 0,42 (хлороформ:метанол:вода = 70:30:5);ВГ = 0,62 (уксусный эфир:и-бута 55нол:пиридин:уксусная кислота:вода =42:21:21:6:10) в количестве 5,64 г(71,27 от теории).Исходный продукт получают следующим образом.6 14таминовой кислоты (0,68 моль воды) вовиде бесцветного лиоАилизата с Гд,= 42:21;21:6;10).Исходный продукт получают следующим образом,Раствор 20,7 г (32,46 ммоль) (СЫ)-метилэфир-(СУ)-бензилэфира 4,6-0-изопропиллиден-И-пронионил-дезметилмурамил-Ь-аланил-Р-глютаминовойкислоты в 400 мл 60%-ной уксуснойкислоте мешают в течение 21 ч прикомнатной температуре, затем упаривают в вакууме при 30 С и полученныйостаток последовательно трижды смешивают каждый раз со 100 мл воды иснова упаривают, Полученный сыройродукт очищают путем хроматографиина колонне на 1000 г геля кремневойкислоты 60 (Мерк, 0,063-0,200 мм) всистеме метиленхлорид:метанол = 85:. (70,1% от теории).Исходный продукт получают следующим образом,В суспензию из 13,2 г ( 35,77 ммоль)натриевой соли 4,6-0-изопропилиден-И-пропионил-дезметилмураминовой кислоты в 200 мл диметилформамида добавляют при комнатной температурепри мешании 9,6 г (46,5 ммоль) дициклогексилкарбодиимида, 5,35 г(Сс)-метилэфир-(СУ)-бензилэфира Ь-алании-Р-глютаминовой кислоты и всемешают в течение 21.ч при комнатнойтемпературе,Полученную таким образом белуюсуспензию смешивают с 200 мл уксус 13 1299515,12 г (10,1 ммоль) д.-метиловогоэфира Б-пропионилдезметилмурамил-Ь --аланил .Р-глютаминовой кислоты полностью растворяют в 100 мл смесихлороформ:изопропанол = 7:3 и в результате добавления 10 мл диметилформамида.К этому раствору добавляют 2,68 г(13 ммоль) дициклогексилкарбодиимидаи 1,50 г (13 ммоль) И-оксисукциними 1 Ода и полученный в результате этогопрозрачный бесцветный раствор мешаютв течение 1 1/2 ч при комнатной температуре и затем выдерживают 17 чо 15при 4 С,Полученную таким образом суспен зию смешивают с 400 мл диэтиловогоэфира и затем перемешивают еще втечение 1 ч при комнатной температу 20рееЗатем кристаллизат отсасывают,промывают диэтиловым эфиром и высушивают в вакууме над пятиокисью фос.фора.25Получают сырой (Сд)-метилэфир-СУ)-Б-оксисукцинимидэфир-И-пропионил-дезметилмурамил-Ь-аланил-Р-глютаминовой кислоты в виде бесцветныхкристаллов, содержащий в виде примеси дициклогексилмочевину и используемый без последующей очистки.ВГ = 0,46 (хлороформ:метанол =51 )ВГ = 0 72 (хлороформ:метанол =Э357:3) Выход сложного эфира 8,34 г.Исходный продукт получают следующим образом,Раствор 13,0 г (21,75 ммоль) (Сс)-метилэфир-(С 7)-бенэилэфира Б-пропионил-дзметилмурамил-Ь-аланил-Э-глютаминовой кислоты в 250 мл смеси диметоксиэтан:вода = 20:1 гидрируется2,5 г катализатора палладий на угле(10%-ный) в течение 1 ч при комнатной температуре и нормальном давлении.Затем катализатор отфильтровывают,фильтрат упаривают в вакууме до сухого состояния и полученный остатоктрижды смешивают с водой в количестве по 50 мл и снова упаривают.Осадок растворяют в приблизительно 100 мл бидистиллированной воды,фильтруют этот раствор через фильтрс миллипорами (БАЬ СЕБЕЯ; 0,2 мкм)и лиофилизируют в глубоком вакууме,Получают Ы -метиловый эфир И-пропио-нил-дезметилмурамил-аланил-Р-глю25 15 12995ного эфира, перемешивают в течение1 ч при 0 С, отделяют от кристаллизатора (дициклогексилмочевины), нанутч-фильтре, промывают ледяным уксусным эфиром и Фильтрат упаривают вовакууме при 30 С. Полученный такимобразом остаток вводят в 300 мл уксусного эфира и дважды последовательно промывают 50 мл 2 н, лимонной кислоты, водой, 103-ным раствором гидрокарбоната натрия и снова водой.Зфирные слои объединяют, высушивают над сульфатом натрия, Фильтруюти упаривают в вакууме.Получают (СЮ)-метилэфир-(С )-бенэилэфир 4,6-0-изопропилиден-пропионил-дезметилмурамил-Ь-аланил;Р-глютаминовой кислоты.ВГ = 0,65 (хлороформ:метанол =9:1); 20ВГ = 0,86 (хлороформ:метанол == 5:1) в количестве 21,3 г (93,3 Х оттеории).Оба исходных продукта получаютследующим образом.К раствору 20,3 г (48,0 ммоль)-Р-глютаминовой кислоты в 100 мл абсолютного уксусного эфира добавляют 30при 0 С 100 мл приблизительно 5 Б соляной кислоты в абсолютном эфире имешают 2 ч при 0 С,Желтоватыи раствор упаривают в вакууме, полученный остаток дважды смешивают каждый раз со 100 мл абсолютного эфира и снова упаривают. Последигерирования с абсолютным диэтиловымэфиром (2 х 100 мл) остаток высушиваютв вакууме и получают гидрохлорид= 9:1) в количестве 1,7 г (94,87. оттеории).Раствор 34,4 г (73,8 ммоль,2,14 ммоль), содержащий хлорид натрия натриевой соли 1 с -О-бензил,6-0-иэопропилиден Б-пропионил-дезметилмураминовой кислоты в 340 мл воды,гидрируют при постоянном значении 16 16рН = 7,1 6,0 г 1 ОЖ-ного катализаторапалладий на угле в течение 23 ч прикомнатной температуре и нормальномдавлении, Затем катализатор отфильтровывают, Фильтрат упаривают в вакууме при 30 С и при рН = 7,1; и полученный таким образом остаток высушивают в высоком вакууме над пятиокисью Фосфора. Получают натриевую соль4,6-0-изопропилиден-Б-пропионил-дезметилмураминовой кислоты (16,6 г,94,87. от теории)ВГ = 0,50 (хлороформ:метанол:вода = 70:30:5);.ВГ = 0,66 (ацетонитрил:вода == 3:1).Исходный продукт получают следующим образом.Раствор 14,3 г (32,7 ммоль) мети-.лового эфира 1 с -О-бензил,6-0-изопропилиден-И-пропионил-дезметилмураминовой кислоты в 130 мл метаноласмешивают с 24,4 мл (48,7 ммоль) 2 н.натрового щелока и перемешивают втечение 1 1/2 ч при комнатной температуре.Затем полученный таким образомпрозрачный желтоватый раствор с помощью 1 н. соляной кислоты доводятдо значения рН = 7,0 и упаривают ввакууме при 30 С.После сушки над пятиокисью Фосфо.ра получают натриевую соль 1 с -0.в .бензил,6-0-изопропилиден-Б-пропионил-дезметилмураминовой кислоты в виде бесцветных кристаллов в количестве27,2 г.ВГ = 0,67 (хлороформ.метанол:вода = 70:30:5);ВГ0,74 (ацетонитрил:водаЗф 1).Исходный продукт получают следующим образом.К суспензии из 6,75 г ( 224,7 ммоль)гидрида натрия в 120 мл абсолютноготетрагидрофурана добавляют по каплямопри 5 С в атмосфере азота при постоянном помешивании в течение 5 минраствор 31,3 г (85,65 ммоль) 1 с.-О-бензил-дезокси,6-0-изопропилиден-пропионамид-Р-глюкопиранозида в 200 мл абсолютного тетрагидро"фурана, причем температура повышается до 20 С,Полученную таким образом суспензию перемешивают еще 2 ч при 40 С,затем охлаждают до 0 и добавляютпо каплям в атмосфере азота и непрерывном помешивании в течение 30 мин