Способ получения десульфатогирудина

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИК Ь 15/ 5 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ИЗОБРЕТЕНИЯ ОПИСА К ПАТЕНТУ(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДГИРУДИНА(57) Изобретение относинологии, в частности кжеродныхполипептидов в дрожжевыхклетках, 11 елью изобретения являЕСУЛЬФАТО тся к биотехполччению чузобр ние относится к биотехчастности к получению чулипептидов в дрожжевыхя повышение в я в том, что контную плазмидную идные промотор й из С 1 о-Яа 21 рагмента плазми Ьр, связайногоом Вр 111 с Вя 111- ым Фрагментом .- ром 266 Ьр Яа 1 1- азмиды р 1 РВ 207/6,3 1 сЬ иплазмидыразмером 643 Ьр ровачие 1 ель изобретени да целевого продукта Способ заключаетс струируют рекомбинан ДНК, содержащую гибр РНО 5-САРВН, состоящи РН 05, промоторного Ф, ды р 31/1 размером 5 синтетическимлинкер ЕсоК 1 САРВН промоторн йлазмиды рСА 1)Н разме Н 1 пй 111-фрагмент плЯО 1630616 ется повышение выхода целевого продукта. Способ заключается в том, что;конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК, кодирующую синтез десульфатогирудина путем объединения ВавН 1"Яа 11 фрагмента векторной плазмидырЮВ 20 С размером 6,3 ЕЬ с гибридным промотором РН 05-САРВН, состоящим из ВанН 1-ВягЕНРН 05-фрагментаплазмиды р 3/У, связанного линкерамиВд 111 с промоторным Фрагментом ВР 111 ЕсоК 1 САРВН плазмиды рСРВН-Е и Нда 1 ВащН 1-фрагментом плазмиды рМ 13101размером 0,2 1 Ь, кодирующим десульФатогирудин, Штамм Я. сегетяаеСКР 18 трансформируют полученной Дкультивируют клетки в среде, содержащей 0,03 г/л дисульфатиридина,4 табл. содержащий дисульфатогирудин Няа 1- Ващ 111-Фрагмент плазмиды рИ 1,310 Е размером 0,2 1 Ь трансформируют полученной рекомбинантной плазмидной ДНК итамм дрожжей Я.сегечя 1.ае СКГ 18, культивируют трансформированные клетки, в жидкой культуральной среде, содержащей 0,03 г/л дегидрогенфосфата калия. П р и м е р 1. КонстрН 05 промоторных делеций,а) Ва 131 расщепление. Рекомбинантный Фаг И 13 мр 9/НРО 5 Ваш-Яа 1, содержащий ВащН 1-Яа 11-фрагмент РН используют в качестве источника РН 05 промотора, 20 кг Фага ДНК (К репликативная Форма) расщепляют р20 19 1630616 Продолжение табл.1 дин, и Нра 1-ВашН 1-фрагмент плазмиды.,рМЬ 310 Ь размером 0,2 1 Ь, трансформи-,ру 10 т рекомбинантной плазмидной ДНКштамм дрожжей Яассйагошусеа сетечдвдае ОКР 18, культивируют трансфор-.,мированные клетки в жирной культуральной среде, содержащей 0,03 г/лдигидрогенфосфата калия,Таблица 110-88 -57 -33 Т а б л и ц а 2 Положение последнего нуклеотида последовательности РН 05 Клон22Продолжение табл. 3 1630616 Правая" Делеция От До нЛев Числонуклеотидовделеции К Таблица 4 Десульфатогирудин (мг/л культурального бульона/ОД 6 ) Плазмида рЛ)В 207/РАРЕХНЕК (УА 81)рЛ)В 207/РАРР 1- НТК (УА 81)рЛВВ 207/РАРР 1- Н 1 К(ТА 81+УАБ 2)рЛВВ 207/РАРЕ 1- НТК(УАЯ 1+УАБ 2) 2 о 2,2 3 0 2,8 Составитель Т,ЗабойкинаТехред М.ДидыкКорректор С,П 1 екмар Редактор Н,ЯцолаЗаказ 445 Тираж 372 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и .открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,01 Е Р Сц В А 627 Д 28 Й 29 ДЗО Ь 3125 стрикционной эндонуклеазой БаП, получая линейную ДНК приблизительно9 Г:Ь, После экстрагирования смесьюфенол/хлороформ ДНК осаждают этано 5лом. ДНК повторно суспендируют в10 мМ трис, рН 8,0 в концентрации0,5 мкг/мл, 16 мк ДНК, отщепленнойБа 1 Т, расщепляют 2 ея экзонуклеазыВА 131(БКЬ) в 100 мл 20 мМ трис, 10рН 8,0, 199 мм Г)аС 1, 12 мМ МяС 1,12 мМ СаС 1и 1 Ф( БАЛТА. Лликвотныечасти 2 мкг ДНК каждая отбирают после 1, 2, 3, 4, 5 и б мин инкубирования при 30 С и немедленно смешивают с 1550 мкл Фенола и 60 мкл ТГ)Е. Послеэкстрагирования смесью Фенол/хлороформ и осаждения этанолом, ДНК повторно суспендируют в 1 0 мМ трис,рН 8,0, при концентрации 100 мкг/мл,Для анализа степени экзонуклеолитического отщепления Ва 131 ,5 мкг ДНКдля каждого момента времени расщепляют эндонуклеазой БашНТ и анализи, руют на 1,57,-ном агарозном геле втрис-боратном буфере, рН 8,3 (90 мМтрис-НС 1, рН 9,3, 90 мИ борной кислоты, 2,5 мГ 1 ЕДТЛ). В среднем 100 Ьрудаляют с каждого конца фрагмента за1 мин Ба 131 расщепления.30б) Добавление ЕсоКТ линкеров к обработанной Ва 1.31 ДНК. Две с д.А боЕсоКТ линкеров (5 -ССААТТСС, ВКЬ)повторно суспендируют в 250 мкл 10 мМтрис-НС 1, рН 8, 1 мИ ЕДТА, 2 мкгЕсоК 1 линкеров обрабатывают киназой вв 75 мкл 60 мМ трис-НС 1, рН 7,5,10 мМ МдС 1, 15 мИ ДДТ, 10 мкИ ЛТРи 33 ед.Т 4 полинуклеотидной киназы.Через 1 ч при 37 С смеси дают остыть цдо комнатной температуры, а затем хранят при -20 С,о,Отожженные двунитевые ЕсоКТ линкеры связывают тупыми концами с ДНК-фрагментами, обработанными Ба 131, 450,5 мкг ДНК, обработанной Ва 131, инкубируют в течение 16 ч при комнатной температуре с 50-кратным избыткомЕсоК 1 линкеров, обработанных киназойи 20 мкл 60 мМ тряс, рН 7,5, 10 мММяС 1, 10 мМ ДТТ, 4 мМ АТР и 600 ед,14.ДНК-лигазы, После инактивированияТ лигазы (10 мин при 65 С) избытокЕсоК 1 линкеров отщепляют 50 ед. ЕсоК 1в Объеме 50 мкл, ДНК экстрагируютсмесью фенол/хлороформ, .осаждают эта 55нолом н повторно суснендируют в 10 мМтрис-НС 1, 1 мИ ЕДТА (-ТЕ). Затем ДНКотщепляют 5 ед, ВашН 1 и полученную смесь вносят в 1,57,-ный агарозныйгель с низкой температурой плавленияв трис-боратном буфере. Полосы охра-(шивают этидиумбромидом и визуализи-,руют длинноволновым УФ-светом при .366 нм. Широкие диффузные полосымежду около 100 п.о, и 600 п,о. вырезают из геля, и ДНК экстрагируют., в) Лигирование в И 13 мр 9. 3 мкгМ 13 мр 9 расщепляют 15 ед. ЕсоКТ;и 15 ед.БашНТ в объеме 50 мкл, После экстрагирования фенолом и осаждения этанолом ДНК повторно суспендируют в50 мкл ТЕ. 5 мкл отрезков векторнойДНК (около 200 нг) смешивают с 10 мклуказанных образцов (ДНК-Фрагменты,полученные из различных Ва 131 переваров, как описано в примере 1 б) илигируют в полном объеме 20 мкл вприсутствии 60 мМ трис-НС 1, рН 7,5,6 мМ МяС 1, 100 мМ ДТТ, 1 мМ АТР ии 200 ед,Т 4. ДНК-лигазы в течение15 ч проводят трансдукцию компетентных клеток штамма Е,со 11 М 101. Фагивыращивают и анализируют по размеруих ДНК-вставок путем отщепления рестрикционными ферментами ЕсоК 1 иВашН 1,г) Определение Ва 131 конечных точек делеции определением последовательности аминокислотных остатков поСангеру (делеции Ба 11 сайта). Определение последовательностей проводят, используя систему дидеокси-ДНКопределения последовательностей.Конечные точки делеции приведены втабл,1,д) Определение Ва 131 конечных точек делеции определением последова-тельности аминокислотных остатков поСангеру (делении от ВашН 1 сайта),Осуществляют аналогичный набор Ва 131делеций, как описано в пунктах а-вза исключением того, что М 13 мр 9 РН 05Ваш-Ба 1 вырезают с помощью ВатпН 1.Ва 131 расщепленные Фрагменты обрабатывают ЕсоК 1 и Ба 11, и полученныефрагменты клонируют в М 13 мр 9 расщепленный ЕсоК 1 и Ба 11. Конечные точки делеции приведены в табл,2,е) Конструирование внутреннихРН 05 промоторных делеций, Набор Ва 131делеций, описанный под пунктом г51 бЗОб моторных фрагментов, заканчивающихся ЕсоК 1-сайтом, Комбинируя "левые" и 1 етправые в различных положениях создают внутренние делеции, которые5 содержат ЕсоК 1 линкерный сегмент по сайту делетированной ДНК. Отдельные внутренние делеции конструируют, вырезая "левые" и "правые" из М 13 мр 9 производных рестрикционными эндонуклеазами ЕсоК 1 и ВашН 1 ("левые") или ЕсоК 1 и Ба 11 (" правые" ) и выделяя соответствующие фрагменты с помощью электрофореза в мягком агарозном геле, как описано в пункте б. Эквимолярные количества левых , правых и 200 нг ВашН 1 и Ба 11 расщепленных М 13 мр 9 векторных ДНК лигируют, как описано в пункте в. После трансдукции в Е.со 1 д М 101 белые пятна отби рают, определяют КР и анализируют рестрикционным ферментативным анализом (ВашН 1, Ба 11, ЕсоК 1). Куски, приведенные в табл.3, объединяют для создания специфических внутрен них делеций. 40 П р и м е р 2, 1 п тгшо анализвнутренних делеций РН 05 промотора.Различные делеции, описанные в 30,примере 1, клонируют в плаэмидурдПВ 207(РН 05), заменяя дикий типРН 05 Ваш-Ба 1 фрагмента делетированным вариантом. После трансформациидрожжевого штамма Б.сегечзае АН 216.,определяют активность кислой фосфатаэы. Анализ показывает, что тризоны, существенные для РН 05 экспрессии, расположены в следующих положениях:1, между положениями -349 и-125 (ТАТА бокс).ДНК фрагменты, содержащие ИАБ илиИАБ 2 или ИАБ 1 и ИАБ 2 РН 05 можно получить из рекомбинантного фага М 13 мр 9(РН 05) путем отщепления соответствующими эндонуклеазами,П р и м е р 3. Конструированиеслитых РНО 5-САРПН гибридных промоторов.В примерах 1 и 2 конструируютучастки вокруг положений -365 ИАБ 1(РН 05) и другой участок вокруг положения -180 ИАБ 2 (РН 05) РН 05 гена -возможные кандидаты для ИАБ с регулиб6руемыми функциями. ИАБ (РНО 5) содер-.жится в 268 п.о. ВашН 1-С 1 а-фрагменте, тогда как оба ИАБ (РН 05),иИАБ 2 (РН 05) содержатся в 368 п.о.ВашН 1-ВзЕ 11-фрагменте, Каждые дваэтих фрагмента сливают с двумя различными САРПН, которые включают ТАТАбокс и сайты инициирования транскрипции САРПН,а) Конструирование дрожжевой ген-.ной библиотеки . 30 мкг полной высокомолекулярной ДНК дрожжей дикого типаштамма Б 288 С инкубируют в течение30.,мин при 37 фС с 2 ед, ЕсоК 1 метилазы в 250 мкл ЕсоК 1 буфера метилирования. ДНК осаждают этанолом, повторно суспендируют в 500 мкл 25 мМтрис-НС 1, рН 8,5, 2 мМ М 8 С 1 д (ЕсоКЗ.буфер) и расщепляют ЕсоК 1 до тех пор,пока не получат распределение фрагментов ДНК по размерам с максимумом вобласти 30-50 т.п.о, Дрожжевые ДНК,расщепленные в условиях ЕсоК 1Кфракционируют по размерам в градиенте сахарозы (5-207 сахарозы в10 мМ трис-НС 1, рН 7,5, 1 мМ ЕДТА).30 фракций по 0,4 мл каждая собираютс верхнего значения градиента, Фракция 16 содержит ДНК-фрагменты размеом по 30-40 т,п.о. ДНК этой фракции3 мкг) осаждают этанолом и лигируют в течение 16 ч при 150 в полном объеме 15 мкл с 15 мкг космидного вектора рУст., линеаризированногоЕсоК 1. Лигирование проводят 300 ед.ТДНК-лигазы, используя описанную буферную систему. ДНК упаковываетсяп чСго в бактериофаг Я/В, а собранные фаги используют для трансдукцииЕ.со 11 штамма НВ 101 (г 1 с, ш 1 с, 1 шЭВрго , гес А), Эффективность трансдукции составляет около 5000 устойчивыхк ампициллину колоний на мкг рус 1вектора, 300 атпр . колоний отбираюти выращивают в 1,В среде,б) Выделение дрожжевого САРПНгена. Описанную генную библиотекускринируют синтетическим: олигонуклеотидом следующего строения: 5ССТССАТСТТССАССССССС 10 мкг олигонуклеотида обрабатывают киназой, используя 10 мкл 32 р-АТР(3000 Кюри/ммоль, 10 мкКюри/мкл Тполинуклеотидной, киназой. Положительное клонирование детектируют авторадиографически. Выделение плазмид"ной ДНК приводит к получению гибрид-,ного клона, который содержит2100 и о. Н 1 пд 111 Фрагмента, кодирующего САРЭН, Клонированный САРРНген имеет ту же самую последователь-ность, что и рдар 491.5в) Получение САРВН расположенныхниже промоторных, 649 п.о, Тая 1-Фрагмента, который включает положенияот 27 до 675 от АТС САРПН гена выделяют, расщепляя гибридную плаэмиду 10Тая 1, выделяя ДНК-Фрагмент на 1,2 Еном мягком агарозном геле и экстрагируя ДНК горячим Фенолом, Клонирование Та 1-Фрагмента проводят в С 1 а 1 сайт рВК 322. 1 мкг рВК 322 отщепляют тремя единицами С 1 а 1. 300 нг лигируют примерно с 300 нг вставкиДНК (649 1 р Тац 1-Фрагмент), используя 200 ед,Т( ДНК-лигазы в 20 мкл,Трансформирование проводят в Е.со 11 20НВ 101 на устойчивость к ампициллину. Плазмидную ДНК получают и анализируют рестрикционным анализом, Ориентацию Тая 1-Фрагмента устанавливают,используя рестрикционную эндонуклеазуга 1 в сочетании с ВашН 1, Выбираютплазмиду, которая содержит Тад 1 сайтположения -675 вблизи Н 1 пд 111-сайтарВК 322, Эту плазмиду, обозначеннуюрВР 322/САРРН, линеаризируют, используя ВашН 1, а расщепление Ва 131 осуществляют, как, описано в примере 1,за исключением того, что используютВя 111-линкеры, Размер Ва 131 укороченного Та 81-Фрагмента определяют 35рестрикционным анализом (используяВд 111 и Нхпй 111),П р и м е р 4. Экспрессирование десульфатогирудина, контролируемое РН 05-САРВН гибридным промотором, 401, Регулирование нуклеотидной последовательности на 5-окончании десульфатогирудинового Н, Ч, К гена. Нуклеотидная последовательность, кодирующая десульАатогирудин, начинается с СТТ-кодона, стоящего после ИН-терминального валина вконечном продукте. Для удобного субклонирования и экспрессирования в Е.со 11 кодирующую последовательность продол(жают на 5 -окончании с помощью восьми нуклеотидон, включающих ЕсоК 1-ог-раничительный участок и АТС-инициирующий кодон. Для точного скелетного слияния гирудиновой кодирующей после 55 довательности с последовательностью кодирующей РН 05 сигнальный пепфгид, эти дополнительные нуклеотиды удаляют путем измерения ЕсоК 1-ограничительного участка в участок растущегоокончания, добавления синтетическогоолигонуклеотида, содержащего участок распознавания НвА 1 в таком положении, что последующее расщепление с помощью Нра 1 происходит непосредственно сверху от СТТ-кодона,, Ведение Няа 1 ограничительногоучастка перед десульфатогирудиновымгеном. 8 мкг плазмиды рМ 310 (ЕР168342) исчерпывающе расщепляют спомощью ограничительной эндонуклеазы ЕсоК 1 ДНК, экстрагируют системойФенол/хлороформ и осаждают этанолом,Выступающие концы в положении 5 уда(ляют нуклеазой Я(, ДНК рМ 1.310/ЕсоК 1в количестве 4 мкг расщепляют в100 мл смеси, состоящей из 250 мМИаС 1, 1 мМ ЕпБО, 30 мМ ацетата натрия при рН 4,6.с помощью 20,ед./млнуклеазы Б( (Сигма) в течение 45 минпри 37 оС.ДНК экстрагируют смесью онол/хлороформ и осаждают этанолом, ДНК(рМ 310/ЕсоК 1/Б 1 повторно суспендируют в 100 мкл раствора, содержащего50 мМ трис-НС 1, рН 8,0, и инкубируютв присутствии 2 ед, щелочной осфатазы кишечника теленка в течение 1 чпри 37 С, Энзим инактивируют в течение 15 ч при 65 С,Концентрацию ЫаС 1 в инкубационнойсмеси устанавливают равной 150 мМ,Деосфорилированную ДНК (рМ.310/ЕсоК 1/Б /С 1 АР) очищают путем адсорбции на ионообменной;колонке ДН 52 вбуфере с низким содержанием солей(150 мМ МаС 1, 10 мМ трис-НС 1, рН 8,0)1 мМ ЕДТА) и затем элюируют буфернымраствором с высоким содержанием солей (1,5 мМ ИаС 1, 10 мМ трис-НС 1,рН 8,0, 1 мМ ЕДТА), ДНК осаждают этанолом и повторно суспендируют в НдОв концентрации 0,8 мг/мл.)Олигонуклеотид Формулы 5АСССТССАСССТ-З, синтезируют Фосфотриэфирным методом. Получают самокомплементарную последовательность олигонуклеотидов, содержащую участок распознавания -САССС-ограничительнойэндонуклеазы НяА 1. Отжиг двух одинарных нитей приводит к получению двунитевой ДНК-связки иэ 12 пар азотис-,ть 1 х оснований.ЪСинтетический однонитевой олигодеоксинуклеотид в количестве 1,2 мкггфосфорилируют в 10 мкл системы, состоящей из 60 мМ трис-НС 1 с рН 7,5,10 мМ М 8 С 1, 5 М МДТТ, 301 С 1 (-32 р)АТР (3000 С ммольи 6 ед.Т,1 поли-.5нуклеотидекиназы в течение 30 минФпри 37 С с последующим замещением втечение 15 мин в присутствии 0,5 мМАТР. Полученную смесь дополнительноинкубируют в течение 1 О мин при 75 Сс целью инактивации энзима и затемохлаждают до комнатной температурыдля отжига.Меченную по эР ДНК-связку в количестве 0,6 мкг (170 пмоля) смешивают с 2,4 мкг (1,75 пмолей концов)рМ 1310/ЕсоК 1(Б)С 1 АР и лигатируют в20 мл смеси, состоящей из 60 мМтрис-НС 1 рН ,5, 1 О мМ М 8 С 1 д, 5 мМДТТ 3,5 мМ АТР 800 ед,Т 1 ЛНК-лигазы, в течение 20 ч при 150 фС. Лигазу инактивируют в течение 1 О минпри 85 С и избыток молекул связкиоудаляют осаждением ДНК в присутствии1 О мМ ЭДТА с рН 7,5, 300 мМ ацетата 25натрия с рН 6,0 и 0,54 объемов изопропанола, Через 30 мин пребыванияпри комнатной температуре ДНК суспендируют в 45 мкл лигатационной смесии лигнируют в течение 6 ч при 15 С 30с образованием кольцевой ДНК.Аликвоты лигазной смеси объемами1 и 3 мл добавляют к 100 мл обработанных кальцием трансформационных компетентных клеток Е.со 1 ь. НВ 1 01. Клетки оставляют охлаждаться во льду на30 мин, затем инкубируют в течение3 мин при 42 ОС, охлаждают в течение2 мин во льду и инкубируют в течение1 ч при 37 ОС в 400 мкл среды БОБ. 40Полученные клетки концентрируют дообъема 100 мкл и наносят на пластиныс ЬВ агаром, содержащим 50 мкг/млампициллина,45Двенадцать трансформированных ашр колоний индивидуально выращивают в среде ЬВ, содержащей 100 мкг/мл ампициллина. Готовят плазмидную ДНК, Наличие синтетической олигонуклеотидной. связки подтверждают определением последовательности аминокислотных остатков с использованием фрагмента однонитевой ДНК-затравки, которая гибридизуется с кодирующей нитью55 гирудина. Клон, который содержит ДНК-связку в.правильном положении впереди гирудинового гена, обозначен как рМЬ 3101 11, Слияние РН 05 сигнальной последовательности десульфатогирудинового структурного гена.а) Выделение десульфатогирудинового фрагмента. 12 мкг ДНК-плаэмиды рЬ 310 Ь исчерпывающе расщепляют эндонуклеазами БашН 1 и Руи 1, После экстракции ДНК два укаэанных ограничительных фрагмента отделяют. в 1,27. - ном агарозном геле в трис-борат-ЕДТА буфере, рН 8,3, Из геля выделяют Руц 1- ВашН 1-фрагмент размером 0,84 п,о, ДНК элюируют;-Руц-ВашН 1-фрагмент рМ 131 01, дополнительно расщепляют с помощью эндонуклеаэы Няа 1. В результате расщепления образовывается Няа 1-ВашН 1-фраг" мент размером 198 п.о., который содержит полную кодирующую последовательность для зрелого десульфатогирудина. Дополнительное расщепление с помощью А 1 И 1 не затрагивает этогофрагмента, но устраняет другой Няа 1 фрагмент аналогичного размера.Нужный Нда 1-ВашН 1-фрагмент отделяют от других фрагментов на 157-номагарозном геле в ТВЕ буфере и элюируют. ДНК очищают ионообменной хроматографией, осаждают этанолом, ДНКповторно суспендируют в НдО в концентрации 30 мкг/мл (0,2 пмоль/мкл)Выделение РБ 05 промоторного участка с частью РН 05 сигнальной последовательности, Плазмида р 31/РН 05-ТРА 18имеет.РН 05-промотор и РН 05-сигнальную последовательность, скелетно связанную с инородным структурным геном(й-РА), Фрагмент 584 п,о. ВашН 1-Ва 11содержит РН 05-промотор и всю РН 05-сигнальную последовательность, но с восемью нуклеоттщами на 3 окончании,р 31/РНО 5-ТРА 18 ДНК в количестве8 мкг расщепляют эндонуклеазой Ва 11(16 ч при 37 С). ДНК очищают путемэкстракции смесью фенол/хлороформ иосаждением этанолом, ДНК повторносуспендируют в Н 0 при концентрации0,7 мг/мл,Правильное соединение между РН 05сигнальной последовательностью и кодирующим участком десульфатогирудинаобеспечивается синтетической связкойформулы:(2) 3 -ССТТАССТ СААСА Восемь нуклеотидов на 5 окончании связи (5 -ССААТССА) представляют собой часть РН 05-сигнальной по 163061640 следовательности от участка Ва 11 допрецессионного участка. Пять нуклеотидов, выступающих над окончанием 5 .олигонуклеотида(2), соединяются сучастком НдА 1 расщепления на 5.окончании десульфатогирудиновойкодирующей последовательности,Индивидуальные однонитевые олигонуклеотиды (1) и (2) синтезируют 10Фосфотриэфирным методом. Олигонуклеотиды (1) и (2) в количестве1,1 мкг и 1,8 мкг соответственно индивидуально фосфорилируют на их 5окончаниях, смещивают в эквимолярных 15количествах и отжигают.Йосфорилированную двунитевуюЛНК-связку в количестве 13 мкг(при 85 С, Избыток связок удаляютосаждением ДНК в присутствии 10 м 1 ЧЭДТА, 300 мМ ацетата натрия с рН 6,0и 0,54 объема изопропанола. ДНК повторно суспендируют и дополнительно 30расщепляют эндонуклеазой ВатпН 1. После экстракции ДНК смесью Фенол/хлороформ и осаждения из этанола двауказанных ограничительных фрагментаотделяют в 1,27-ном агарозном геле втрис-борат-ЭДТЛ буФере, рН 8,3. Изгеля выделяют 0,6 т.п.о. Фрагмент.ДНК злюируют и дополнительно очищаютДЕ 52 ионообменной хроматографиейи осаждением этанолом. ГатпН 1-Няа 1ДНК-Фрагмент размером 0,6 т.п.о.повторно суспендируют в НО при концентрации 40 мкг/мл,Выделение рЛЭВ 207 дрожжевого векторного фрагмента, 9 мкг плазмиды 45р,ПЭВ 207 РН 05-ТРА(12-2) расщепляютэндонуклеазой ВапэН 1, ДНК экстрагируютсмесью Фенол/хлороформ и осаждаютэтанолом, суспендируют в 50 мМ трисНС 1; рН 8,0, при концентрации0,1 мг/мл и расщепляют 7 ед, щелочной Фосфатазы кишечника теленка втечение 1 ч прИ 37 ОС, Фосфатазу инактивировали н течение 1,5 ч при 65 С.ДИК очищают ДЕ 52 ионообменной хроматографией и осаждением этанолом.Крупный Фрагмент Вав 1 П размером6,8 т,п,о, отделяют в 1,27,-ном агарозном геле в срис-борат-ЭДТА буФере при рН 8,3. ДНК элюируют и очищают с помощью ДЕ 52 ионообменной хроматографии и осаждением этанолом.ДНК растворяют в воде в концентрации 0,4 мг/мл (0.,1 пмоль/мкл) .Лигатирование РН 05 промоторногоФрагмента и десульфатогирудиновогоструктурного гена с рЛ 1 ЭВ 207. ДрожжевсЭй вектор р,ПЭВ 207, РН 05-примотор-.ный фрагмент с РН 05-сигнальной последовательностью и десульфатогирудиновый структурный ген выделяют в виде Фрагментов ДНК и лигируют их собразованием экспрессионной плазмиды.В течение 20 ч при 15 дС в 10 мклсмеси, состоящей из 60 мМ трис-НС 1,рН 7,5, 1 О мМ МрС 12, 5 мМ ДТТ, 1 мМАТР и 400 ед.Т 4 ДНК-лигазы проводят лигирование 0,3 пмоль 0,6 т,по,ВаН 1-Ноа 1 Фрагмента р 31/РН 05-ТРА 18 и0,3 ймоль 0,2 т,п,о, Ноа 1-ВаН 1 фрагмента рМ 13101. с, 0,1 пмоль 6,8 т,п,о.ВатпН 1 Фрагмента р,ПЭВ 207 Р/РН 05-ТРА(122).Аликвоту лигазной смеси объемом1 мкл добавляют к 100 мкл трансформационных компетентных клеток Е,со 1.НВ 101, Клетки высевают на ЬВ-агаровые пластины, содержащие 50 мкг/млампициллина,АрщК колонии в количестве 24 ед,индивидуально выращивают в ЬВ-средев присутствии 100 мкг/мл ампициллина, Плазмидную ДНК анализируют с целью определения размера и ориентации вставки путем расщепления ограничительной эндонуклеазой Рз 1. Клонс правильной ориентацией вставки обозначают как рЛЭВ 207/РН 05-Н 1 К,Получение плазмиды р,ПЭВ 207/РН 05/(Есо)-НХК, С целью удобного соединения элементов УАВ(РН 05)-САРРН гибридного промотора с кодирующим участком десульфатогирудина, включающимРН 05-сигнальную последовательность(как И в плазмиде р,ПЭВ 207/РН 05-НХК)ЕсоК 1 ограничительный участок вводят в 5 нетранслированную областьмежду исходными участками КНК и АТСкодирующей области.15 мкл плазмиды рЗБВ 207/РНО-НК 1расщепляют эндонуклеазой Пга 1, Полученные в результате четыре фрагментаотделяют в 0,8%-ном агарозном гелев трис-борат-ЭДТА буфере при рН 8,3.С геля регенерируют фрагмент ДНК раз-мером 4,2 т.п.о., подвергают элюированию и осаждают этанолом. ДНК повторно суспендируют в Н О концентрацией О,б мг/мл,Каждый из двух синтетическихолигонуклеотидов, отвечающих Формулам 5 -ААТТССАТТАССААТСТТТи3 -ССТААТССТТАСААА.,(2,3 мкг и2,9 мкг соответственнц), подверга- Оют действию киназы в 20 мкл смеси,состоящей из 60 мМ трис, рН 7,5,10 мИ МрСД, 5 мМ ДТТ, 0,5 мМ АТР и20 ед.Т 4 полинуклеотидокиназы. Через45 мин при 37 С обе реакционные смеси объединяют, нагревают в течение1 О мин при 75 оГ и охлаждают до комнатной температуры. Отожженную олигонуклеотидную связку хранят при-20 С. 20Фрагмент размером 4,2 т.п.о. гАТ.ДНК в количестве 6,5 мкг 2,3 пмоль)инкубируют в течение 16 ч при 5"Св присутствии 70-кратного избытка киназированной и отожженной .олигонуклеотидной связки в 50 мкл смеси, состоящей из 60 мМ трис рН 7,5, 10 мММяС, 5 мМ ДТТ, 3,5 мМ АТР и 800 еп,Т800 ед.74, ДНК-лигазы, После инактивации Т 4, ДНК-лигазы в течение 1 О минпри 85 С избыточные связки удаляютосаждением ДНК в присутствии 10 мМЭДТА, 300 мМ ацетата натрия с рН 6,0и 0,54 объема изопропанола, ДНК расщепляют эндонуклеазами ЕсоК 1 и 35Нпй 11, Полученные в результатеФрагменты отделяют в 1 Е-ном агарозном геле в трис-борат-ЭДТА буфере,рН 8,3, Фрагмент размером 643 элюи: руют и осаждают этанолом, повторно 40суспендируют в концентрации0,1 смоль /мл, Фрагмент ЕсоК-Нпй 11содержит РНО 5 сигнальную последовательность, кодирующую последовательность десульфатогирудина и обрыватель РН 05 транскрипции.Иэ плазмиды р 31/К выделяли 534 п,о,РН 05-промоторный Фрагмент. О мкгр 31/К расщепляют эндонуклеазами ЕсоК 1и ВашН 1, Три Фрагмента отделяют в 500,6 Х-ном низкоплавком агарозном гелев трис"борат-ЭДТА буфере, рН 8,3,ВашН 1-ЕсоК 1-Фрагмент размером 534 п.о.содержит РН 05 промотор, включающийисходные участки шКНК. 556 мкг плазмиды рЛВВ 207/РН 05-НКрасщепляют с помощью ВашН 1 и Ньпй 11Крупный 6,5 т.п,о, фрагмент отделяют от других Фрагментов в 0,67-цомагарозном геле в трис-борат-ЭДТА буФере, рН 8,3,Три описанных Фрагмента ДНК с соответствующими липкими концами лигируют ТУ ДНК-лигазой в соотношении534 п.о. ВашН 1-ЕсоК 1 РНО 5-промоторного фрагмента 0,2 пмоль, 643 п.о.ЕсоК-Нпй 1-Фрагмента (последова.тельность кодирующая гирудин 10,2 пмоль, 6,5 т,п,о, ВашН-Н.пй 1векторного Фрагмента 0,1 пмоль.Аликвоту лигазной смеси в количестве 1 мкл добавляют в 100 мкл об.работанных кальцием трансформационных компетентных клеток Г.сод НВ 01Двенадцать трансформированных ашрколоний индивидуально выращивают вЬВ-среде, содержащей 10 мкг/мл ампициллина, Плазмидную ДНК анализируютс помощью ЕсоК 1 и ВашН 1 ограничительного расщепления, Выделяют одинклон с ожидаемыми ограничительнымиФрагментами и обозначают рЛПВ 207/РН 05(Есо)-Н 1 К.Ч. Лигатирование УАБ (РН 05) -САРВН гибридных промоторов с областьюдесульфатогирудина, кодирующей белок,15 мкг плазмиды рЛЭВ 207 ГНО 5 (Есо)Н 1 К расщепляют с помощью ЕсаК 1 иН 1 пй 11. Фрагменты ДНК отделяют в1 Е-ном агарозном геле в трис-боратЭДТА буфере, рН 8,3, Фрагмент 643 п.о.элюируют и осаждают этанолом, суспендируют в НО в концентрации01 пмоль/мкл. 6 мкг плазмидырЛЙВ 207/РБО 5-НР исчерпывающе расщепляют эндонуклеазой Нжй 11 и Ва 1.Крупный 6,3 т,п.о. Фрагмент (векторная часть) выделяют электрофорезом,экстрагируют Фенолом, осаждают этанолом, суспендируют в 11 ф 1 в концентрации 0,05 пмоль/мкл. 10 мкл плазмиды рСАРЭН-Е расщепляют с помощью Вд 11 и ЕсоК 1, Фрагмент 266 п,о, Ве 11-ЕсоК отделяют на 1,2 Х-ном агарозном геле в трис, борат-ЭДТА буфере, рН 8,3, элюируют, осаждают этанолом, суспендируют в НдО в концентрации 0,3 пмоль/мкг.0,3 пмоль 548 п,о, фрагмента Ба 1- Бя 11, содержащего УАБ (РН 05) 0,3 пмоль 266 и,о. Вя 11-ЕсоК 1-фрагмента рСАРПНЕ, 0,3 пмоль 643 п,о, ЕсоК-Нхпй 11-Фрагмента рЛПВ 207/РН 05 (Есо)-Н 1 К и б,12 пмоль 6,3 п.о. Ба 11630616 Н 1 пй 111-векторного фрагмента лигируют в 20 мкл смеси, состоящей из60 мМ трис, рН 7,5, 10 мМ МдС 1, 5 мМДТТ, 1 мМ АТР и 400 ед,Т ДНК-лигазыв течение 6 ч при 15 С, Аликвоты лигазной смеси объемами 1 мкл и 3 мклдобавляют к 100 мкл обработанныхкальцием клеток Е.со 1 х НВ 101, Выделение плазмиды из ашр колойий и ограничительный анализ с помощью Ба 11,Вя 111, ЕсоК 1 и Н 1.тЫ 111 проводят согласно описанному, Выбирают один положительный клон и ему присваивают обозначение рЖВ 207/РАРЕ 1-Н 1 К (УАБ 1),Аналогичную конструкцию создают спомощью 201 п,о. Вя 111-ЕсоК 1-фрагмента, выделенного из рСАРРН-Р 1. Одной выделенной плазмиде дают обозначение рЮВ 207/РАРЕ 1-Н 1 К (УАБ 1), 20Ч, Лигирование УАБ 1 (РН 05)-УАБ 2(РН 05)-САРРН гибридных промоторов спротеин-кодирующей областью десульфатогирудина. Плазмиды рЛРВ 207/РАРЕ 1 Н 1 К(УАБ 1 и р 1 РВ 207/РАРЕ 1-Н 1 К(УАБ 1) 25в количестве 3 мкг каждая расщепляютс помощью Вя 111, После экстракции феиолом и осаждения этанолом 3 рецессивные окончания ДНК заполняют в реакции с Е.со 11. ДНК-полимеразой Гфрагмент Кленова), Энзим инактивируют втечение 10 мин при 70 С. ДНК дополнительно расщепляют с помощью Ба 11и 7,2 т.п,о, фрагменты выделяют электрофорезом на мягком агарозном геле,экстракцивй Фенолом и осаждением этанолом, КаждьпГ фрагмент повторно сус.пендируют в НО в концентрации0,05 пмоль/мкл. Такие Фрагменты содержат гирудин-кодирующую область, 40большинство векторных последовательностей и любой из двух различныхСАРРН промоторных элементов, выделенных из рСАРРН-Е 1 или рСАРРН-Р 1,Плазмиду р 31/У расщепляют с помощью ВзСЕ 11, инкубируют с помощьюЕ.со 11. ДНК-полимеразы (фрагмент Кленова) согласно описанному и расщепляют с помощью Ба 11. фрагмент649 п.о. отделяют на мягком агарозном геле и регенерируют экстракциейфенолом и осаждением этанолом,0,3 пмоль 649 п,о, фрагмента р 31/УвкГГючающего УАБ 1-УАБ 2 (РН 05) промоторный элемент и 0,15 пмоль каждого из 7, 2 т э Г 1о. Фря"ментов лигируюти трансформируют в клетки Е.со 1.ь.НВ 101, Плазмиды получают иэ ашр коФлоний и анализируют ограничительнымрасщеплением. Выбирают единичныеколонии и их плазмидные ДНК обозначают как рЗРВ 207/РАРЕ 1-Н 1 К(УАБ 1+УАБ 2)и р.ТРВ 207/РАРЕ 1-Н 1 К(УАБ 1+УАБ 2).П р и м е р 5. 31 п.о. ДНК-после"довательность является достаточнойдля выполнения функций фосфат-контролирующего элемента,31 п.о. последовательность изверхней области РН 05-промотора (положение от -381 до -351), ограниченнаядвумя боковыми делециями 10 и 013пример 1 е), может потенциально содержать регуляторный сигнал. Это предположение может быть проверено путемсинтеза двух комплементарных олигонуклеотидов, имеющих следующие структуры: 5 Г-ААТТССАААТАТАТАТТАААТТАССАССТТТТСССАСи 3 -ССТТТАТАТАТААТТТААТССТССАААА СССТСТТАА Эта последовательность содержит31 п.о, последовательность к кото)рой примыкают ЕсоК 1 ограничительныеучастки, Такие участки ЕсоК 1 позволяют легко осуществлять полимеризациюпоследовательности с образованиеммультимеров,а) Клонирование 31 п.о, элементав вектор 1.Т 98. Каждый из двух синтетических олигонуклеотидов, взятыхв количестве 50 пмоль, обрабатывают20 ед, ТЧ полинуклеотидокиназы в20 мл смеси, состоящей иэ 60 мМ трис,рН 7,5 10 мМ М 8 С 1 щ 5 мМ ДТТ,0,5 мМ АТР, Через 45 мин инкубациипри 37 С обе реакционные смеси объединяют, нагревают в течение 10 минпри 75 С и охлаждают до комнатной .температуры, Отожженные олигонуклеотиды хранят при -20 С. Киназированныеи отожженные олигонуклеотиды в количестве ,5 пмоль лигируют в течение30 мин в объеме, равном,15 мкл, Затем добавляют ЕсоК 1-фрагмент 1,Т 98векторной ДНК (0,075 пмоль) и; инкубируют в течение 6 ч. После трансформации клеток Е.со 11 НВ 101 плазмидывыделяют и анализируют путем расщепления с помощью ВашН 1, выбирают индивидуальные плазмиды с 1, 2, 3, 4 или5 фрагментами ЕсоК 1 и проводят определение последовательности аминокис-.лотных остатков (по методу Сангера)ПоказанЬ что культиплетные 31 п,о,элементы клонированы в ориентацииот головы к хвосту, 817б 3061640 Клетки трансформантов Я.сегечяае СРР 18 выращивают в 10 мл среды РИсо без аминокислот, в которой добавле 55 но 2% глюкозы и 20 мг/л 1,-гистидина, в 50 миллиметровой Эрленмейеровской колбе, при встряхивании в течеб) Клонирование в р.ШВ 207. Олигомеры 31 п.о, испытывают на их промотор-контролирующую функцию путем их встраивания вверх от Р элемента САРВН 5 промотора, Плазмиду рЮВ 207/РАРЕ 1- ЕС 1(ТАЯ) укорачивают с получением плазмиды с вычеркнутым элементом УАЯ 1. Такую плазмиду расщепляют с помощью Ба 11 и Вд 111, очищают на геле О и выделяют крупный векторный фрагмент, В независимой реакционной смеси эту же плазмиду расщепляют с помощью ВашН 1. Рецессивные 3 окончания заполняют ДНК-полимеразой Кле нова, используя для этой цели все четыре НТФ. Участки с тупыми концами расширяют с помощью фосфорилированных Вя 111-связок и после расщепления с помощью Яа 11 и Вд 111 путем 20 очистки на геле выделяют ДНК фрагмент, имеющий приблизительную длину 400 п.о. Крупный векторный фрагмент лигируют с Яа 11-Вя 111 фрагментом длиной около 400 п,о. с использованием Т ДНК-лигазы. После трансформации Е,со 11 НВ 01 и выделения плазмиды получают плазмиду, не содержащую РН 05 УАЯ. Такую плазмиду обозначают как рЖВ 207/САРР 1-ЕС 1, Эту плаэмиду расцепляют с помощью Вд 111 и она служит вектором для клонирования 31 п,о, олигомеров, 1 198, содержащую 1, 2, 3, 4 или 5-олигонуклеотидных вставок расщепляют с ВашН 1. Фрагменты различного размера выделяют очисткой в геле и независимо лигируют с рЛОВ 207/ САРР 1-ЕС 1 разрезанной эндонуклеазой ВР 111. Смесь расщепляют с Вя 111 для удаления нежелательного повторно лигированного вектора без ДНК-вставки и затем используют для трансформации Е.со 1 НВ 101, Полученные плазмиды анализируют ограничительным анализом с помощью ЯаП и 45 Пга 1 (участок внутри САРЭН промоторной части) .П р и м е р 6. Экспрессия поли- пептидов.1 тамм СРР 18 разновидности Яассйагошусея сегеудяае трансформируют полученными плазмидами. ние 24 ч при ЗОдС до плотностиЗх 10 кл,/мл. Эти клетки промывают0 9%-ным раствором МаС 1 и используютдля инокуляции 50 мл минимальной среды с низким Р., полученной согласнорецепту для среды ПГсо ,еаза Мго 11 еп Вазе (без аминокислот, но содеркащей 0,03 г/л КНОР 04, 1 г/л КС 1 и10 г/л 1.-аспарагина вместо (ИН 4)802% глюкозы и 1 г/л Е-гистидина).Культуры инокулируют до достиженияплотности порядка 4 х 1 О кл,/мл и перемешивают со скоростью 200 об,/минв Течение 42 ч при ЗООС,Дрожжи секретируют десульфатогирудиновые соединения в культуральный бульон, После ферментации втечение 22 ч иэ культуральной средыотбирают образец объемом в 10 мл иего обогащают протеинами путем обессоливания и концентрирования на колонке. Колонку дважды промывают1,5 мл системы вода - ацетонитрил(9:1) - 0,1% трифторуксусной кислоты. Десульфатогирудиновые соединения элюируют с колонки системой вода -ацетонитрил - 0,1% трифторуксуснойкислоты (3:2 об,/об,). Элюат в количестве 2 мл концентрируют до конечного объема 400 мл, Десульфатогирудин идентифигируют анализом с применением жидкостной хроматографии высокого давления, проводя сравнение саутентичным десульфатогирудином ис помощью пробы на ингибирование тром-бина.Полученные результаты представлены в табл,4,Ф о р л у л а изобретенияСпособ получения десульфатогирудина, предусматривающий выделение и очистку целевого продукта, о т л и - ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта и упрощения способа конструируют рекомбинантную плаэмидную ДНК, содержащую гибридный промотор РН 05-САРРН, состоящий из С 1 а 1-Яа 11 РНО 5 промоторного фрагмента плаэмиды р 31/У размером 545 Ьр, связанного линкером Вд 111 с Вя 11 Е-ЕсоК 1 САРПН промоторным фрагментом плазмиды рСАВН размером 266 СЪр, Яа 11-,Нпй 111-фрагмент плазмиды рШВ 207/РН 05-Н 1 Р размером 6,3 1 Ь, ЕсоК 1-Нжс 1111-фрагмент плазмиды рЖВ 207/РН 05(Есо)-НТК размером 643 Ьр, кодирующий десульфатогиру