Способ получения фруктозилдисахаридов

(19) 01 С 12 Р С 12 Р 19/188, С 12 К 1;125 ТЕ АТЕНТУ ится к микробиовеществ, касаение откосу синтезуба полученригодныхществ в пицифическиаемые. фруют собой гическо ия фруктозилдисакачестве сахащевой промьппленизвестных как 1а. тозилдисахариды ромеж)точнйй про, ется спо харидов,ристых вености, спТСР (полу представл ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗОБ(71) Тейт энд Лайл Паблик Лимитед Компани (СВ)(56) Незйгз.п агк 1 Ач 1 пай.,1. Вз.осЬет, 1958, 69, р. 388-398.Патент Великобритании Р 2046757, кл, С 08 В 37/00, опублик, 1980 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФРУКТОЗИЛДИСАХАРИДОВ(57) Изобретение относится к микробиологическому синтезу веществ, касается способа получения фруктозилдиса харидов, пригодных в качестве сахаристых веществ в пищевой промьпплен"ности, специфически известных какТСР, Получаемые фруктозилдисахаридыпредставляют собой промежуточный продукт для использования при получе" Брин Ратбоун, ЭндрюПетер Самуэль и Джейм нии сукралозы (ранее известной какТСБ). Цель изобретения - повьппениекачества целевого продукта, Способпредусматривает проведение реакцииальдозы с сахарозой или рафинозой вприсутствии фруктозилтрансферазы,продуцируемой ВасП 1 пя зцЬ).1).з ИС 1 ВР 11871, 11872 или 11873, имеющей Кшдля сахарозы по меньшей мере 0,1 Мв отсутствие акцептора альдозы, которая не образует значительных количеств левана, осаждаемого спиртомиз донора фруктозы в отсутствие акцетора альдозы стабильной к действиюповерхностно-активных веществ, которая обладает оптимальной активностью при 30 фС, и активной в течениепо меньшей мере 20 мин при температуре до 45 С, Предлагаемый ферментне проявляет инвертазной активностичто благоприятно влияет на качественные характеристики целевого продукта, а также не ускоряет реакциюдиспропорционирования, т.е, не превращает олигосахариды с малой молекулярной массой в леван с высокоймолекулярной массой, 1 з,п. ф-лы,1 табл. кт для использования при получении кралозы, ранее известной как ТСБ) Цель изобретения - повышение каства целевого продукта,Изобретение предусматривает полу" ние фруктозилдисахаридов общей рмулы проведением реакции. альдозы щей формулы, где А - водород или группа СНХ;Х в ;,.;,водород, алифатическая или 1 Оароматическая карбоксигруппа;ьили улкоксигруппа или арилМалкоксигруппа,с сахаровой или рафинозой в присутствии фруктозилтрансферазы, продуцируе1 мой Васг.11 цв вцЬС 11 в НС 1 В 11 11871,11872 или 11873, характеризующейсяКш для сахаровы по крайней мере 0,1 Мв отсутствие акцептора альдозы, необразующей значительных количествосаждаемого спиртом полисахарида-.левана из донора фруктозы в отсутствие акцептора альдозы, и стабильной к действию поверхностно-активныхвеществ, имеющей оптимальную активность при ЗОфС, активной не менее20 мин при 45 ОС, Используемый Фермент не проявляет инвертазной активности, что благоприятно влияет накачественные характеристики целевого 30продукта. Кш для Фруктозилтрансфера зы, полученнойиз В.яцЬС 111 з НС 1 В11871, составляет 0,2 М для сахаровы в отсутствие акцептора, в отличиеот известного, Кш которого равна0,02 М.Используемая Фруктозилтрансфераза не ускоряет реакцию диспропорционирования, т,е, не превращает олигосахаридьг с малой молекулярной массой в леван с высокой молекулярноймассой.Источником Фруктозы для реакцииможет быть любой олиго- или дисахарид, содержащий, предпочтительно, 45незамещенное Р-Фруктозильное кольцо, присоединенное к аномерному углероду альдозы связью (1 -- -2), какв сахарове (-П-Фруктозил-М-Р-глюкопиранозид), рафинозе (О0-галактопиранозил-(1 в -ь 6)-00-глюкопиранозил-(1 в -,2)0-фруктофуранозид) или стахиозе,Реакцию между донором и акцепторо ФРУктозы проводят при РН 5,4- 556,0 и 30 С, оптимальных значенияхдля действия Фермента, который, предпочтительно, используют иммобилизо-ванным на нерастворимой подложке. 20 Продуцируемые фруктозилтрансфераэой штаммы Б.вцЬг11 в по классическим тестам отвечают требованиям идентификации видов. В.вцЪг,111 в ИС 1 В 11871является лактозоотрицательным, показывающим различное продуцированиекислоты и ксилозы. В,вцЬг.11 в ИС 1 В11872 также является лактозоотрицательным и дает отрицательные Результаты с В-маннозой, мелибиозой и трегалозой в реакции ОБРС. В.вцЬ 1 в БС 1 В11873 является лактозоположительным идает отрицательные результаты с 0-маннозой и инулид 0.П р и м е р 1. Получение 6-ацетата сахаровы,а) Получение фермента. 5-Фруктозилтрансферазу получают при культивировании Вас 11 цв яцЪСП 1 в, штамм ИС 1 В11871. Фермент индуцируют сахароэойв процессе роста клеток во встряхиваемых колбах (емкость 250 мл, 4 колбы),содержащих минимальную сахароэнуюсреду (100 мл на колбу). Культуруинкубируют до последней экспонентнойфазы микроорганизмов, встряхиванияпри 30 С, затем содержимое четырехколб объединяют и культуральную среду отделяют от клеток путем центрифугирования (5000 я в течение 15 мин),20-30% общего количества ферментаостается в ассоциации с клетками,Полученную надосадочную жидкостьдоводят до 65% насыщения путем добавления твердого сульфата аммонияи оставляют стоять в течение 45 минпри 0 С, В результате этого в осабдок выпадает основное количествонежелательной инвертазы и других белковых составляющих, а большая частьФермента остается в растворе. Затемобразец повторно центрифугируют(20000 я в течение 30 мин) и выгружают осадок, содержащий инвертаэу.Добавляют. еще сульфат аммония в раствор для доведения его до 95% насыщения и оставляют стоять еще на 45 минпри ОС, Образуется второй осадок,в основном Фруктозилтрансфераза,которую собирают центрифугированием (40000 я в течение 45 мин) иповторно растворяют в 12 мл 50 мМФосфатного буфера, РН 6,0. Результатом двух осаждений и растворениявторого осадка является очистка иконцентрация Фермента, такая, что спомощью электрофореза с полиакриламидным гелем обнаружена только од 1630617на полоса белка, Оставшийся сульфат аммония удаляют из системы получения фермента путем диализа (О С втечение 4 ч) в присутствии 50 мМ фосфатного буфера.Подвергнутый диализу фермент ис -следуют перед и после добавленияп-оксиртутьбензоата, который подавляет инвертаэу, но не оказывает действия на фруктозилтрансферазу. Обычно этим способом определяют., что препараты фруктозилтрансферазы свободны от инвертазы. Содержание протеинов в препаратах оценивают примерно0,45 мг/мл путем определения абсорб ции белков при длине волны 280 нм,Черный пигмент часто присутствуетдаже в очищенных ферментных препаратах, но он не оказывает влияния наих активностьб) Получение 6-ацетата сахарозы,6-Ацетат глюкозы (80 г высушивают ввакууме до постоянного веса) и гранулированную сахарозу (160 г) растворяют при .комнатной температуре в100 мл буферного раствора Макилвайнапри рН 5,4 и разводят до 600 мл т,е,40 мас.%) деионизованной водой. Этотраствор затем профильтровывают и добавляют 28 мл раствора фермента. Реакционную смесь инкубируют при 30 С,отбирают через определенйые временные интервалы образцы до тех пор,пока по данным ЖХВД не устанавливают,что 6-ацетат сахарозы больше не образуется и достигнута максимальнаяконцентрация 6-ацетата сахарозы120 г/л. Фермент удаляют фильтрованием реакционной смеси через колонку с ДЭАЭ целлюлозой, которая адсорбирует фермент. Другим способом егоможно было денатурировать путем нагревания при 65 фС в течение 1 ч.Удаление фермента важно, так как онможет способствовать медленному гидролизу 6-ацетата сахарозы и высвобождать фруктоэу,Затем продукт выделяют с помощьюпрепаративной ЖХВД и получают 6-ацетат сахарозы по меньшей мере 65 чистоты при общем выходе 50%. Начальная скорость реакции ферментациисоставляет 244,5 мг 6-ацетата сахарозы на 1 мг фермента в час. Выходна стадии ферментации составил 58%в расчете на.расход 6-ацетата глюкозы или 48% в расчете на образовавшийся 6-ацетат сахарозы. П р и м е р 2. Получение. 6-деоксисахароэы.Выделение, очистка и кристаллизация. 6-Деокси-глюкозу (О-хиновозу, 20 г) и сахарозу подвергают реакции, аналогичной реакции, описаннойв примере 1, и получают смесь 6-деоксисахарозы, Р-хиновозы, сахарозыи глюкозы, общий объем 140 мл. 6-Деоксисахарозу отделяют от смеси спомощью препаративной ЖХВД, используя колонку с обратной фазой ча 1 егвргераЕ 50 О-С 1.8 и воду в .качестве 15 элюента, Наблюдается удивительно большое различие во времени удер 1жания 6-деоксисахароэы и времениудержания других компонентов смеси.0-хиновоза, сахароза и П-глюкозаэлюированы через 4-9 мин после введения, а 6-деоксисахароза только через 29 мин (высота максимального пика)Длительное время выделения позволяет выделить больное количество 25 вещества за инъекцию, чем было бывозможно в другом случае. Элюат, содержащий 6-деоксисахарозу, выпаривают досуха при пониженном давлении(температура бани 50 фС) и получают 30 прозрачный сироп (16,7 г, 42 ), который кристаллизуется при комнатнойтемпературеПродукт рекристаллиэуют иэ этанола и он имел т.,пл, 180181 С, (+57,6 (с 2,5, вода).Масс-спектр, ш/е: 293 (И -СН-Бф).С-ЯМР-спектр (ПдО раствор, относительно молекулярного ДСС при 0 м.д.:Атом углерода Химический сдвигм.д.40 21 106,321 94,705 84,03 79,045 77,74 45 4 76,733 74932 73,954 71,096 65,02 50 11 63,776 19,36П р и м е р 3. Повторяют процедуру, описанную в примере 1, но вмес"то 6-ацетата на стадии б используют 55 6-бензоат гпокозы, Получают аналогичный результатП р и м е р 4, Способ, описанныйв примере 1, модифицируют, используя фермент, полученный при культиви 7 1630617 . 830 Используя субстрат ксилоза-саха - роза для приготовления ксилсахарозы, концентрацию и активность истощенного раствора, оставшегося после завершения процедуры иммобилизации, сравнивают с концентрацией и активностью первоначального ферментного препарата. Обнаружено, что 68,57 первоначально присутствовавшего Фермента 5 в клеточном экстракте было иммобилизовано вместе с 833 первоначапьно присутствовавшего белка. Иммобилизо ванный Фермент имеет первоначальную активность 80,27, от активности эквивалентного количества свободного фер 1 мента; активность обоих препаратов соответственно равна 0,38 г ксилсахарозы / г иммобилизованного Ферменровании штамма Марбург 168, штаммМСТЯ 11872 или 11873 на стадии бРеакция проходит таким же образом, нос меньшей скоростью.П р и м е р 5. Иммобилизация и5очистка Фруктозилтрансфераэы штаммаЯСТВ 11871 с использованием ионообменной ДЭАЭ целлюлозы и получение ксилсахарозы,Ионообменную ДЭДЭ целлюлозу (РЕ 52)интенсивно промывают 50 мМ буферомМакилвайна рН 5,4 и затем забуференным субстратом (сахароза-ксилоза 2:1,40 мас,Е, общие сахара). После Фильтрования почти досуха через воронкуБюхнера ДЭАЭ целлюлозу (10 г) смешивают с 8 мл препарата фруктозилтрансферазы, полученной при культивировании В,яцЪ 11 хя как в примере 1, в течение 15 мин при 30 С при1 перемешивании, Полученную смесь ДЭАЭцеллюлозы и Фермента загружают в10-миллилитровую колонку с водянойрубашкой (19 х см) и поддерживают при,2530 С с помощью термоциркулятора Черчилла. ДЭАЭ целлюлозе дают стечь поддействием собственной тяжести и этистоки собирают. Субстрат. закачиваютвверх по колонке со скоростью1,0 мл/ч, используя насос Ватсона-.Марлоу, элюат собирают через определенные промежутки времени и исследуют на активность Фруктозилтрансферазы, Также определяют поглощениена длине волны 280 нм (Р ). Для исследования О,1 мл жидкого образцаили 0,1 г иммобилизованного фермента(на РЕ 52) инкубируют с 2 мл субстората при 30 С в течение 4 ч, ,40 та в час и 0,865 г ксилсахарозы/ мл экстракта Фермента в час.Иммобилизованный фермент (10 г) непрерывно подают в колонку при 30 С в течение 2 нед при постоянном рН элюата, микробиологическое заражение исключено. В течение первых трех дней небольшие количества белка и Фермента. десорбировались (примерно 247 первоначально адсорбированного белка и 2,3 Е первоначально адсорбированного фермента). Активность иммобилизованного Фермента падает с временем полураспада 95 ч, и имеется обратная зависимость между степенью конверсии субстратов в продукты и скоростью течения по колонке. При самой малой скорости потока, 0,086 объемах колонки без насадки (экв./ч ) и 803 конверсии в ксилсахарозу получают элюат, содержащий 21 г/л ксилсахарозы. Этот выход выше, чем выходы, полученные в периодических реакциях, вероятно потому, что кинетика течения со структурным ядром колонки способствует образованию ксилсахарозы, так как про-. дукты непрерывно выгружают из колонки и, таким образом, они не аккумулируются и не вызывают замедление реакции, В целом в процессе этих операций 20"25 г ксилсахарозы образуются в состоянии, из которого легко получить чистую ксилсахарозу.В противоположность первоначально использованному растворимому ферменту иммобилизованный Фермент вызвал образование в процессе реакции побочных продуктов. Образовалось незначительное количество фруктозы - меньше, чем образуется с помощью первоначального экстракта фермента, использованного для иммобилизации, вероятно потому, что инвертаза, которая загрязняет экстракт, только частично адсорбирована РЕ 52. В элюате после иммобилизованного фермента были обнаружены некоторые второстепенные соединения, которые были элюирова; ны на последней стадии КВД со временем удерживания 13 и 20 мин, хотя их не обнаруживали при анализе продуктов реакций с растворимыми Фермента-ми. Вероятно это огтигосахариды, об-разовавшиеся иэ обычных реагентов с помощью фермента. Предположительно, что удерживание молекул реагента иммобилизованным ферментом увеличиваетнатурируют путем нагревания (или вальтернативе его можно удалять путемадсорбции в ДЭАЭ целлюлозу), Измеряют как количества ксилозы и рафинозы при общей концентрации сахара30 мас.7, так и абсолютную концентрацию сахаров, при отношении рафиноэа: ксилоэа 2:1 (мас./мас.). Наибольшие концентрации ксилсахарозы, полученные в ходе этих экспериментов, составляют 9,5 г/100 мл при концентрации субстрата 65 г/100 мл. Затемксилсахароэу изолируют посредствомпреиаратного 11 р/с, представляющегособой последний пик, подлежащий элюированию, с временем вьщерживания15,5 мин (ксилоэа около 3 мин, рафиноза и мелибиоза примерно по 7 минуткаждая).П р и м е р 7, Образование 6-деоксисукрозы,Осуществляют реакцию рафинозы иб-деоксиглюкозы, как было описано,используя отношение рафиноза: 6-деоксиглюкоза 2:1 и общую концентра-цию сахара 307 По истечении времени инкубации примерно 40 ч получают4 г 6-деоксисахарозы на 100 мл субстрата.Результаты исследований по примерам 1-7 приведены в таблице,Формула изобретения 1. Способ получения фруктозилдисахаридов общей формулы Н и"Оцф ОН НО"СН 20 Н. И) Н,2 Х д или группа д, алифатиче ическая карб коксигруппа, игруппа ия реакции ал водор водор д Х ая или аро и и а алкок.путем проведещей формулы ьдозы об" ОН. время их контакта с ферментом такимобразом, что существует воэможностьполимеризации.Так как содержание ксилозы в субст рате составляет 133 г/л, то максимально возможная концентрация ксилсахарозы составляет 266 г/л. Максимальная концентрация при 0,086 экв./ч.сбставляет 807, от этой величины, т.е, 10210 г/л, а расчетные данные на осно. вании расхода ксилазы во время реак 1.ции составляют 69, 57. Выход .выше,чем в периодических реакциях, так какприрода процесса течение со структурным ядром" такова, что она обусловливает постоянный отток продукта, итак как продукт относительно неполярный по сравнению с субстратом и поэтому избирательно отводится от положительно заряженной иммобилизирующейподложки, то оба эти эффекта способствуют образованию ксилсахарозы.Этот же способ используют для получения 6-ацетата сахарозы иэ 6-ацетата глюкозы, 6-О-метилсахароэы из6-О-метилглюкозы и 6-0-бензилсахарозы из 6-0-бензилглюкозы.Фермент, полученный по способу,описанному в примере 1, (0,1 мл) смешивают с 2 мл 407.-ного (мас,/об,)раствора сахарозы и ксилозы (1:1),забуференного при рН 5,5 при 30 фС.Наличие ксилсахарозы определяют с помощью ЖХВД, Образование левана опре-,.деляют визуально. Ниже приведены результаты сравнения действия различных ферментов. 1Эти ферменты по изобретению преобразуют по меньшей мере в 10 раз 40больше ксилсахарозы чем фермент,полученный с помощью штамма Марбурга, и по меньшей .мере в 100 разбольше в случае использования фермента, полученного с помощью штаммаЬС 1 В 11871. Причем значительно. меньшеидет конкурирующее образование ле- гвана.Использование рафинозы в качестве донора.50П р и м е р 6. Образование ксилсахарозы,Рафинозу и сахарозу растворяют вбуфере Макилвайна (рН 5,4) и инкубируют с фруктозилтрансферазой из примера 1 при 30 С до момента, когдаанализ рЬ/с показал, что больше необразуются ксилсахароза и мелибиозапримерно 100 ч 3 Затем фермент деА СН 0 Н1630617 Ксилсахароза, г/млферментав час Образование Источник фермента левана 8,6 2,9 1,4 0Заметно 0,08 0,19 0,87 Составитель И.ПриваловТехред М.ДидыкКорректор М,Пожо Редактор В, Данко Заказ 445 Тираж 351 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Б, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101г где А имеет указанное значение,определенное для формулы (ХХ), с сахарозой или рафинозой в присутствиифермента гликозилтрансферирующего действия, продуцируемого ВасП 1 ия яидг 1511 я при оптимальных условиях действия фермента, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что, с целью повьпления качествацелевого продукта, в качестве фермента гликозилтрансферирующего действия используют фруктозилтрансферазу,продуцируемую Вас 111 ця яиЬг 1.я ЮСХВВ 11871, 11872 или 11873, имеющую Кйдля сахарозы по меньшей мере 0,1 Мв отсутствие акцептора альдоэы, необразующей значительных количествосаждаемого спиртом левана из донора фруктозы в отсутствие акцептораальдозы, и стабильную к действию поверхностно-активных веществ имеющую оптимальную активность при температуре 30 С, активную не менее 20 . -омин при температуре до 45 оС,2, Способ по п. 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что используют иммобилиэованный фермент,ИСХВ 11871НСХВ 11872ИСХВ 11873ЬСХБ 3610