Способ получения бычьего, свиного или человеческого проинсулина

ОЮЗ СОВЕТСКИХОЦИАЛИСТИЧЕСНИ ИЮ ( РЕСПУ 61 К 37/О 4 С 07 НОМИТЕТ СССРЕНИЙ И ОТНРЫТИИ ГОСУДАРСТ 8 ЕННЫ ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕ Н(11 Я 75 1975. ГО, СВИ- НСУЛИНА оа. ОР дине- асте прох, неда,иного илиПИ), коую активОПИСАНИЕ ИЗ ПАТЕНТУ(71) Эли Лилли знд Компани(72) Брюс Хилл франк (ПЯ)(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЫЧЬЕНОГО ИЛИ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ПРОИ(57) Изобретение касается сний, родственных пептидамности получения бычьего, свчеловеческого проинсулинаторый проявляет биологическ сть и может быть использован в биологии и медицине. Упрощение процесса достигается переводом Я-сульфонатных групп соответствующего исходного пептида в дисульфидные мостиковые группы с помощью другого. реагента - меркаптана, взятого в ко"личестве, обеспечивающем 1-4 эквивалента Я-ЯН-фрагмента на каждыйЯ-ЯОз-фрагмент, Процесс ведут в водной среде при рН = 9-11, концентрации Я-сульфонатного полипептида,равной 0,1-7,4 мг/мл водной среды,и температуре 6-21 С, Величину рНреакционной среды поддерживают дбавлением 0,05 М раствора глицинСпособ обеспечивает проведеницесса в одну стадию в условиятребующих присутствия кислоро1 э,п. ф лы, 4 табл,1301319 5 Ю 15 20 25 50 55Изобретение относится к способуполучения бычьего, свиного или человеческого проинсулина - биологически активного соединения, применяемого в биологии и медицине.Цель изобретения - упрощение процесса.Получение исходных продуктов.Линейный цепной Я-сульфонатныйпредшественник инсулина.К 100 мп охлажденной деионизированной 7 М мочевины добавляют 786 мгсульфита натрия, раствор перемешивают, добавляют 594 мг тетратионатанатрия, перемешивание продолжают,однако раствор остается мутным, Устанавливают рН 7,7 ледяной уксуснойкислотой, При перемешивании добавляют очищенный с помощью НРЕС бычийпроинсулин (503 мг), УстанавливаютрН реакционного раствора 7,6 2 н, гидроокисью натрия, Полученный мутноватый раствор перемешивают при 6 С втечение 18 ч,Приблизительно половину реакционной смеси отделяют, устанавливаютрН 9,1 с помощью 2 н, гидроокиси натрия, и вводят в колонку с сефадексомЖ(грубый).Условия хроматографирования: растворитель - 0,05 М бикарбонат аммония;рН 9,0; размеры колонки 2 х 90 см;о. температура 21 С; скорость, потока18,5 мл/мин,Первые 120 мл вытекающей жидкостисливают, а следующие 75 мл собирают,Затем колонку промывают другой порцией 0,05 М бикарбоната аммония прирН 9,0 (400 мл), Эту процедуру повторяют для второй половины реакционного раствора, Уф-спектры двух пуловпоказывают, что получено всего 401 мгПулы объединяют и лиофилизируют досуха, Получают 445,7 мг сухого обессоленного продукта, Строение полученного продукта - линейного цепногоЯ-сульфонатного бычьего проинсулинаи отсутствие исходного материалаподтверждено электрофорезом на ацетате целлюлозы и полиамидным дисковым гель-электрофорезом,Линейный цепной Б-сульфонатныйбычий проинсулин чистят хроматографией на ДЕАЕ-целлюлозе Неочищенныйобразец (443 мг) растворяют в 1 О млсмеси 7,5 М мочевина - 0,01 М Трис -0,00 1 М ЕДТА при рН 8,5 и вводят вколонку с ДЕАЕ-целлюлозой. 2Условия хроматографиравания: раст.воритель - 7,5 М мочевина - 0,01 МТрис - 0,001 М ЕДТА, рН 8,5 с градиентом 0-0,35 М хлористого натрия; раз.меры колонки 2,5 х 90 см; температурао4 С, скорость потока около 0,9 мл/мин;объем фракций 5,3 мл,Поглощение при 276 нм для каждойфракции, построенное в зависимостиот номера фракции, указывает на большой пик с небольшим хвостом. Уфспектроскопия показала, что большойпик и есть получаемый продукт, фракции 199-240 с объемом вытекшей фазы1069-1291 мл объединяют, Уф-спектрдля этого образца соответствует355 мг,Полученный пул обессоливают наколонке с сефадексом Ж(грубый).Условия хроматографирования:растворитель - 0,05 М бикарбонат аммония; рН 8,0; размер колонки 3,7 хОх 105 см, температура 4 С; скоростьпотока 16,0 мл/мин. Первые 396 мл жидкости сливают,а следующие 250 мл собирают и сохраняют, Затем колонку промывают другой порцией 2000 мл 0,05 М бикарбона 30 та аммония с рН 8,0,УФ-спектр этого пула показал321 мг этого образца. Образец лиофилизируют досуха, Собирают 373 мг сухого материала, Идентичность продук 35 та подтверждается полиакриламидным дисковым гель-электрофорезом и высокоэффективной жидкостной хроматографией низкого давления НР 2 РЕС на основании времени элюирования,40 В следующих примерах описано получение бычьего, свиного или человеческого проинсулина,П р и м е р 1, Концентрация0,1 мг/мл. К раствору 1,61 мг линейного цепного Б-сульфонатного бычьего проинсулина в 16,1 мл дегазированного 0,05 М глицина (рН 9,5) добавляют 0,158 мл водного 2-меркаптоэтанольного раствора, который при титровании реагентом Эллмана показал содержание меркаптана 2,11 мг/мл, что соответствует 4 экв. 2-меркаптоэтанола на - БЯОз - в линейном цепном Я-сульфонатном бычьем проинсулине. Окончательное значение рН 9,46, Раствор, приготовленный при комнатной температуре, запаивают парафином, а за,О тем перемешивают при охлаждении доо6 С в течение 19 ч,Затем реакционную смесь подкисляют до рН 4,0+0,1 (терморегулировка),используя концентрированную солянуюкислоту и 0,5 н, гидроокись натрия,Выделяют продукт, Строение подтверждено высокоэффективной жидкостной хроматографией низкого давления(НРЕР 2 С).Условия НР 2 РЕС следующие: колонка 1,1 х 54 см, стеклянная колонка,заполненная ЛП/С, с содержаниемС 16,6 Е; растворитель - ЗОЖ ацетонитрила и 703 01 М формиата аммония, рН 4,25; температура 21 С; давление 8028 г/см ; скорость потока2,40 мл/мин.Образец вводят в колонку с помощью 5 мл пробного петлеобразного инжектора и работают на длине волны280 нм,Первый введенный образец представлял собой 5 мл раствора бычьего проинсулина с номинальной концентрациейпротеина 0,1 мг/мл; второй введенныйобразец - 5 мл подкисленной реакционной смеси. Наличие мономерного бычьего проинсулина в реакционной смесиподтверждено на основании времениэлюирования, Расчет площадей пиковдвух циклов НРЕРЕС показал, что выход бычьего проинсулина в реакционной смеси составил 82,6 Е.Результаты исследований представлены в табл, 1. 25 Остаточные значения являются средними по трем определениям (30 ч гидролиза), А 1 а = 1,0,П р и м е р 2, Концентрация0,5 мл/мг,ЗО К раствору 25,07 мг линейногоцепного Б-сульфонатного бычьего проинсулина в 50,14 мл дегазированного0,05 М глицина, рН 10,51, добавляют1,302 мл водного 2-меркаптоэтанольного раствора, который при титрова-нии реагентом Эллмана имеет концентрацию меркаптана 2,10 мг/мл, чтосоответствует 2,1 экв, 2-меркаптоэтанола на - ИБО - в линейном цепзном Я-сульфонатном бычьем проинсулине. Окончательное рН 10,47Раствор, приготовленный при комнатнойтемпературе, запаивают парафином изатем перемешивают при охлаждениио45 до 6 С в течение 18 ч.Реакционную смесь подкисляют дорН 4,0 ф 0,1 (терморегулировка), используя концентрированную солянуюкислоту и 0,1 н. соляную кислоту,50 Анализ с помощью НР 2 Р 2 С поКазал693-ный выход бычьего проинсулина вреакционной смеси,Полученный продукт после обессоливания выделяют с помощью гель 55 фильтрующей хроматографии устанав. ливают рН реакционной смеси 9,0 концентрированной гидроокисью аммония ивводят в колонку, заполненную сефадексом Ж,(В 1) изприродного го(В 1) изприродного АминоВ 1 из проинсулинапо примеру 2 кис 5 лотавяжьего говяжьего инсулина проинсулина А 1 а 2,93 2,92 2,93 2,98 2,97 2,98 Азр ТЬг 0,96 Бег 2,56 0,93 0,91 2,60 2,57 7,16 7,14 7,11 20 Рго 0,88 01 у 4,04 251/2 Суз 5,47 0,79 0,85 4,02 4,02 5,45 5,00 4,49 4,51 4,54 Ча 1 0,58 0,54 5,86 5,87 5,83 1.еи 3,84 3,93 3,90 Туг 2,89 2,83 2,88 РЬе Ндз 1,99 1,93 1,90 1,19 1,06 0,99 0,99 0,98 0,99 Агя 5 13013Условия хроматографического обессоливания: растворитель - 0,05 М бикарбонат аммония, рН 9,0; размеры колонки 2 х 90 см; температура 21 С;о скорость потока 18,5 мл/мин,Первые 120 мл полученной жидкости сливают, следующие 75 мй собирают (протеиновый пул), Затем колонку промывают другой порцией 400 мл 0,05 М бикарбоната аммония с рН 9,0. О УФ-спектр протеинового пула показал, что выделено 21,6 мг протеина, Этот пул лиофилизируют досуха, Получают 22,21 мг сухого обессоленного протеина.Часть этого материала (14,94 мг) растворяют в 5,5 мл 1,0 М уксусной кислоты.УФ-спектр прозрачного раствора показал, что концентрация протеина составила 2,56 мг/мл, 5 мл этого раствора (12,8 мл по данным УФ) вводят в колонку,с сефадексом Ж(сверхтонкий)Условия хроматографирования: растворитель - 1 М уксусная кислота; размеры колонки 1,5 х 100 см температура 21 С; скорость потока 0,19 мл/мин; 30объем фракций около 1,9 мл,По мере элюирования в течение ночи 1 М уксусной кислоты записываютпоглощение на длине 280 нм, На полученной кривой - два пика, Первый, 35меньший, пик соответствует агрегатным формам бычьего проинсулина; второй пик - мономерному бычьему инсулину, Пулы собирают для двух пиков,ПоМученные фракции объединяют, 40 Пул 1: фракции 30-46 (55,0-84,0 мл;пик 70,4 мл),Пул 11: фракции 47-62 (84,0112,0 мл; пик 99,8 мл), 45По данным УФ-спектров в пуле 1 содержится 1,94 мг, в пуле 11 - 10,11 мг,т,е, всего 12,05 мг (выход 94,7 отколичества, введенного в колонку).Всего выделяют 83,97 мономерного бычьего инсулина.Оба пула лиофилизируют досуха.Продукт пула 1 идентифицирован какбычий проинсулин на основании времени элюирования в цикле НР 2 РЕС, что 55также подтверждено с помощью обработки трипсином и карбоксипептидазой В (табл. 2),П р и м е р 3, Влияние температуры.Процедуру примера 1 использовали для определения влияния температуры на выход бычьего инсулина излинейного цепного Б-сульфонатногобычьего проинсулина,Условия реакции: концентрация,протеина 0,1 мл/мг; буфер - 0,05 Мглицин; рН 9,5; меркаптан - 2-меркаптоэтанол в количестве, обеспечивающем 4 экв. - БН на - ББОд-, время 18 ч.Проведение реакции при 21 С обеспечивает выход проинсулина 477. по.еп 4,0 3,87 Туг 3,0 2.,96 2,0 1,91 2,0 1,96 4,0 3,95 Аг 8 Остаточные значения являются средними для трех определений (30 ч гидролиза), А 1 а = 1,0,П р и м е р 5, Влияние концентрации протеина на выход продукта,Процедуру примера 1 используютдля определения влияния концентрации протеина на выход бычьего проинсулина из линейного цепного Я-сульфонатного бычьего проинсулина в ряде реакций, проводимых одновременно.Условия реакций: буфер - 0,05 Мглицин; рН 9,5; меркаптан - 2-меркаптоэтанол в количестве, обеспечивающем 4 экв, - ЯН на - ЯЯО - вреомя 18 ч; температура Ь С,По данным НН 2 Р 2 С изменение концентрации протеина следующим образом влияет на выход проинсулина:Концентрация про- Выход, 3теина, мг/мл Таблица 3 50 7 130 319данным НР 2 Р 2 С. В случае, если реагеноты смешивают при 21 С, а затем прооцесс проводят при охлаждении до 6 С,выход 777П р и м е р 4, Влияние рН,Процедуру примера 1 используютдля определения влияний рН на выходбычьего проинсулина из линейного цепного Я-сульфонатного бычьего проинсу- Р олина в ряде реакций, проводимых одно- Ювременно,Условия реакций: концентрацияпротеина 0,5 мг/мл; буфер - 0,05 Мглицин; меркаптан - 2-меркаптоэтанолв количестве, обеспечивающем 2 экв. - 15ЯН на - ЯЯОз, время 1 8 ч; температура 6 С,По данным НРЕР 2 С выход проинсулина следующим образом зависит отрН: 11 ерН Выход, 7 го9,0 43,19,5 44,310,0 66,710,5 76,0г 511,0 61,0РЬеПул 1 - 22,1 мг; пул 11 - 28,3 мг;пул 111 - 103,6 мг, что составляет154 мг и соответствует выходу 947. отколичества, введенного в колонку, Из 1 у звыделенного количества 63, 7 Х составляет мономерный человеческий проинсулин, Все три пула замораживают и. лиофилизуют досуха,Из трех пулов собирают 106,55 мгсыхого материала. Идентифицируют человеческий проинсулин аминокислотныманализом и полиакриламидным дисковымгель-электрофорезом, а также на основании времени элюирования на рН ЬС, 40при котором ожидается выход человеческого проинсулина по отношению кпроинсулину бычьему, Дальнейшую идентификацию проводят при обработкетрипсином и карбоксипептидазой В до 45получения человеческого инсулина1301319 0,3 46 0,4 37,6 25,4 0,5 12 1,0 Условия реакций: концентрацияпротеина 0,1 мг/мл, буфер - 0,05 М О глицин; рН 9,5; меркаптан, 4 экв.ЯН на - ЯЯОз-, время 18 ч; температура 6 С,По данным НР 2 РЕС тип меркаптанаследующим образом влияет на выход 5 проинсулина: 0,5 77,2 Меркаптан Выход, Х 0,96 58,3 Дитиотреитол 39,3 20 1,83 19,5 Дитиоэритритол 34,9 4,2 Метилтиогликолят 20,1 56,1 19,6 3-Меркапто - 1,2-пропандиол 65,5 7,4 3-Меркаптопропионоваякислота Причем в двух последних случаяхотношение БН: - БЯОЗ - = 1,2.П р и м е р 6. Влияние отношения - БН: - БЯО - на выход проинсулина.Процедуру примера 1 используютдля определения влияния отношенияБН к - ЯБО - на выход бычьего проинсулина из линейного цепного Б-сульфонатного бычьего проинсулина в рядереакций, проводимых одновременно.Условия реакций: концентрация протеина 0,5 мг/мл;. буфер - 0,05 М глицин; рН 9,5; время 18 ч; температу ра 6 С,По данным НР 2 РЕС изменение соотношения - ЯН; - ЯЯО - следующим образом влияет на выход проинсулина: 65,3 2-Меркаптоэтанол 64,1 45Выход, 7 Отношение -ЯЯОз Выход, Х 4,0 30,8 Линейный цепнойБ-сульфонатныйпроинсулин 50,2,0 44,7 37,0 Бычий 60,6 55 0,5 4,5 Свиной 65,8 При проведении другого цикла опытов для 2 экв, - ЯН на - БЯО - и при рН 10,5 получают следующие результаты: Концентрация про- Выход, 7 теина, мг/мл П р и м е р 7, Влияние типа меркаптана на выход проинсулина,ОПроцедуру примера 1 используют для определения влияния строения меркаптана на выход бычьего проинсулина из линейного цепного Я-сульфонатно",о бычьего проинсулина в ряде реакций, проводимых одновременно. П р и м е р 8, Влияние типа протеина на выход проинсулина,Процедуру примера 1 используютдля определения влияния типа протеина на выход проинсулина из линейного цепного Я-сульфонатного проинсулина в ряде реакций, проводимыходновременно.Условия реакций: концентрацияпротеина .0,1 мг/мл; буфер - 0,05 Мшлицин; рН 9,5; меркаптан - 2-меркаптоэтанол в количестве, обеспечивающем 4 экв. - ЯН на - БЯОз-, вреомя 18 ч; температура 6 С,По данным НР 2 Р 2 С выход проинсулина следующим образом зависит от типа протеина; П р и м е р 9. Получение человеческого инсулина, 11 1301 3К раствору 169,3 мг биосинтетически полученного линейного цепногоБ-сульфонатного человеческого проинсулина в 338,6 мл дегазированного0,05 М глицина (рН=10,54) добавляют7,71 мл водного раствора 2-меркаптоэтанола, который при титровании реагентом Эллмана показал концентрациюмеркаптана 2,08 мг/мл, что соответствует 2 экв, 2-меркаптоэтанола на880 - в линейном цепном Я-сульэфонатном человеческом проинсулине,С помощью 5 н, гидроокиси натрия доводят рН до 10,52Раствор запаиваоют парафином и перемешивают при 6 С 5в течение 18 ч,Затем, реакционную смесь подкисляют до рН 2,9+0,1 (терморегулировка)концентрированной соляной кислотой,Полученный прозрачный раствор вводят 20в колонку, заполненную сефадексомЖ(грубый), для обессоливания,Условия хроматографирования: растворитель - 27-ная уксусная кислота;размеры колонки 5 х 100 мм; температура 25 С; скорость потока 28,8 мл/мин;объем фракции 20,2 мл.Первые 789 мл полученной жидкостисливают, а следующие 464 мп собирают и сохраняют, Определение оптической плотности на 280 нм показало,что это протеиновый пул, Колонку промывают дополнительно 2500 мл 2 Х-нойуксусной кислоты, Расчеты на основании данных УФ-спектра для протеинового пула показали, что выход протеина164 мг, что соответствует 101,9 Т количества, введенного в колонку (теоретический выход геГоппайдоп реакции), Этот пул замораживают и лиофилизируют досуха,Целевой продукт выделяют, используя гель-фильтрационную хроматографию. Сухой продукт (не взвешенный)растворяют в 20 мл 1 М уксусной кислоты. Полученный прозрачный растворвводят в колонку, заполненную сефадексом Ж(сверхтонкий).Условия хроматографирования:растворитель - 1 М уксусная кислота;размеры колонки 2,5 х 125 см; температура 25 С; скорость потока 0,82 мл/мин;объем фракций примерно 4,92 мл.В течение ночи колонку элюировали1 М уксусной кислотой; записывали поглощение при 270 нм, На полученнойкривой поглощения на 280 нм от номера фракции получили 2 пика. Первыйпик (меньший) соответствует агрегат 19 12ной форме человеческого проинсулина,второй пик - мономерному человеческому проинсулину (плечо переднейчасти), Собирают три пула фракций,Фракции объединяют,Пул 1: фракции 46-67 (218-325,5 мп);пул 11: фракции 68, 81 (3 25, 6-395, 5 мл );пул 111; фракции 82-100 (395,5490,3 мл). Для этих пулов по данным УФ-спектров рассчитаны следующие количествапротеина;пул 1 - 22,1 мг; пул 11 - 28,3 мг;пул 111 - 103,6 мг,Получено 154 мг продукта, что соответствует выходу 94% от количества, введенного в колонку, Из выделенного количества 67,3 составляет мономерный человеческий проинсулин,Все 3 пула замораживают и лиофилизируют досуха,Из трех пулов собирают 106,55 мгсухого материалаАминокислотный анализ и полиакриламидный дисковый гель-электрофорезподтвердили, что получен человеческий проинсулин, Время его элюирования при ПРЕС соответствует времениэлюирования человеческого проинсулина по отношению к бычьему проинсулину, Дальнейшую идентификацию проводят при обработке трипсином и карбоксипептидазой В (до получения человеческого инсулина).П р и м е р 10, Человеческийпроинсулин-цистеин,К раствору 130 мг человеческогопроинсулин-Я-сульфоната в 404 мп холодного дегазированного 0,02 М глицина с рН 10,4 прибавляют 13,9 млисходного водного раствора цистеина,который имеет содержание меркаптана3,63 мг/мл (титрование с реагентомЭллмана), что соответствует содержанию 50 мас.Е меркаптана в белке,рН 10,5 достигают с помощью прибавления небольшого количества 5 н. гидроокиси натрия, Раствор закрывают иоперемешивают при 6 С в течение 18 ч,После этого реакционную смесьподкисляют до рН 3,8 ледяной уксусной кислотой, По данным жидкостнойхроматографии высокого давления(ЖХВД) выход проинсулина составляет56,3 мас,7. К подкисленной реакционной смеси прибавляют твердую мочевину и получают конечную концентрацию мочевины, равную 4 М. Проинсулин(В)25Н-ЪНАмико ки сЧеловеческий проинсулин Известноезначение лота 13303 выделяют ионообменной хроматографией на ЗР-ЗерЬайех, а затем хромато" графией на РЕАЕ, После этого полученное очищенное соединение очищают гель-фильтрационной хроматогра 5 фией на ЗерЬайех С 508 Р. Полученное соединение является человеческим проинсулином, что подтверждается ЖХВД с одновременным элюированием человеческого проинсулина в качестве Ю сравнения. Выход твердого человеческого проинсулина 43 мас,Х. 12 мг человеческого проинсулина отбирают на аналитические цели в ходе описанной фильтрации (если это количест во включить в результирующий выход, то общий выход проинсулина составит 52 мас.Х).Результаты исследований приведены в табл. 4. 19 4Остаточные значения являются средними для трех определений (30 ч гидролиза). А 1 а = 1,0,Предлагаемый способ позволяет непосредственно, в одну стадию, превращать 8-сульфонат в целевой дисульфидный предшественник инсулина благодаря осуществлению непосредственного обмена в условиях, не требующих присутствия кислорода. Формула изобретения 1. Способ получения бычьего, свиного или человеческого проинсулина общей формулы 1 ау-ЮН ХСуз-8 (Л-гп) (А-г)С уз С уз - Су-Аап-ОНЬ Я818 511РЬе-Суз Сузде дф водо Ьуз- Ага,0 Зр Рго- Рго 2,3,0 Зег,66 ульфонатных групп ептидов общей15 1301319 16где К, Х и У имеют указанные значе,1-7,4 мг на 1 мл водной среды приния, 6-21 С.в дисульфидкые мостиковые группы, 2, Способ по и, 1, о т л и ч ао т л и ч а ю щ и й с я тем, что, ю щ и й с я тем, что величину рНс целью упрощения процесса Б-сульфо- реакционной среды поддерживают, до 5натные полипептиды общей формулы 11 бавляя глицин в концентрации 0,05 М,подвергают взаимодействию с меркаптаном, взятом в количестве, обес- Приоритет по признакампечивающем 1,0-4,0 эквивалента ЯН,03.80 - бычий, свиной проинфрагмента на каждый 880-фрагмент 10 сулин;в водной среде при рН 9-11, концент,11,80 - человеческий проинрации Б-сульфонатного полипептида Т 1 сулин,Составитель В, ВолковаРедактор Л, Веселовская Техред В.Кадар Корректор А, ЗимокосовЗаказ 1163/58 Тираж 348 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб д, 4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород, ул, Проектная, 4