Способ определения тромбина, плазмина, трипсина и тромбиноподобных ферментов в биологических жидкостях

(19 51) О 0 1 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТ Р сР 1 61,0 : г фПАТ идкости с определени ометрическ флюоресцент л и ч а с целью по способа, в ользуют ве гической жследующимролиэа фотчески илирически, отем, что,тельностистрата испформулы Р 23вендсен (Норвегия (Швейцария) 2 ли-про-Х-ИН-Нли мулыг-про-арг-ИН-Нод или блокирующаяная или сульфанильная(54) (57) СПОСОБ О ПЛАЗМИНА, ТРИПСИН НЫХ ФЕРМЕНТОВ В Б ТЯХ путем взаимод одородильна группа ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИ(56) 1. ЗбарскийМаддашев С.Р. ВиолМ., Медгиз, 1960,убстратом с пом продуктов гидспектрометриноспектрофотомет ю щ и й с я тем ышения чувствикачестве субщество общейбавляют 0,25 мл водного раствора субстрата (1 ммоль/мл субстрата по примеру 33 или известного субстрата Й- бз-Фе-вал-арг-рНА НСХ) при 37 С.11 овышение поглощения измеряют спектрофотометрически при 405 нм и за ним непрерывно следят при помощи самопис ца. Количество образовавшегося продукта расщепления представляют собой меру чувствительности субстратов к энзимам. )ОПри вычислении образующегося эа 1 мин и-нитроанилина применяют молярный коэффициент экстинкции 10 000 вместо 9 б 20, так как отношение между расщепляемостью различных субстратов 15 энзимами этим не изменяется. Для вычисления образовавшегося за 1 мин количества (3 -нафтиламина или 4- -метокси-нафтиламина пробу облучают во флуоресцентном фотометре светом длины волн 350 нм. Количество образованшегося продукта расщепления определяют измерением интенсивности испущенного при 420 нм, света.В табл.1 представлена активность тромбина человека, плазмина человека и трипсина крупного рогатого скота измер иная при помощи субстратов согласно изобретению при постоянной конце.нтрации субстрата и энзимов; для сраннения даны соответствующие знакения, определенные при помощи-бзМ 0( -Фе-вал-.арг-рНА НС 1,Иэ табл,1 видно, что субстраты показынают улучшенную по отношению к плазмину человека, а в большинстве 35 случаен значительно улучшенную восприимчивость, чем известный М- бз-Фе"- -вал-арг-рНАНС 1. Перечисленные суб" страты имеют значительно лучшую восприимчивость к трипсину крупного рогатого скота, чем известный сравни тельный субстрат.П р и м е р 34, В табл, 2 представлена активность экарин-тромбина человека, тромбинкоагулязы человека и батроксобина (из яда Вос)1 горэ 45 щоо 3 еп 1), измеоенная посредством субстрата 1 при постоянной концентрации субстрата и энзима; Контролем служат соответствующие измеренные И-бэ-Фе-вал-арг-пНА НС 1-значения. 59П р и м е р 35. Субстраты можно, например, применять также для определения протромбина и антитромбина.Е(ля определения протромбина к 0,5 мл глицинового буфера с рН 8,4 и ионной 55 силой 0,3 прибавляют 5 мкл цитратной плазмы. Смесь инкубируют в течение 30 с при 37 С. Затем к инкубиронанной смеси прибавляют 100 мкл нодного раствора тромбопластина кальция(тромбопластин кальция представляетсобой активатор протромбина). Полученную смесь инкубируют при 37 С.После инкубации в течение 2,5 минактивация протромбина скончена. После инкубации более чем 5 мин исчезает часть активированного тромбинавследствие воздействия содержащихсян плазме антитромбинов.После инкубации через 4 мин к указанной смесиприбавляют 1 мл глициноного буферас рН 8,4, ионной силой 0,3 и температурой 37 вС и затем 0,25 мл1,5"10 "-молярного водного растворасубстрата 1. За ходом гидролизасубстрата следят фотометрическимизмерением количестьа освобожденногоза 1 мин и-нитроанилина при 405 нм.Повышение оптической плотности составляет 0,1 б 2 эа 1 мин. Из этого значения и молярного коэффициента экс"тинкции п-нитрофениланилина при405 нм 10000 вы хисляют значение5,99 вП образовавшегося из протромбина тромбина на 1 мкл плазмы. Из этого нытекает, что 5,99 ед, субстрата1 тромбина было образовано из протромбина на 1 мл плазмы, что соответствует 1 б 2,3 Я 1 Н-единицы тромбина на 1 мл плазмы. Для определенияантитромбина к 1 мл содержащего3 БЯР-единицы гегарина глициновогобуфера с рН 8,4 и ионной; силой 0,3прибавляют 0,1 мл нодногс растворатромбина концентрацией 25-40 И 1 Н-еди.ниц на 1 мл при 37 С. К полученнойсмеси прибавляют 2,5-10 мкл цитратовой плазмы, после чего инкубируютсмесь в течение 30 с при 37 С. К инкубированной смеси сразу прибавляют0,25 мл раствора полибрена (концентрация 1 мг полибрена на 1 мл 0,3-молярного раствора поваренной соли,полибрен представляет собой состоящий из 1,5-диметил,5-диазаундекаметиленполиметобромида продукт. Полученную смесь инкубируют в течение .,д30 с при 37 С. Затем к смеси прибав-.ляют 0,5 мл 0,75 10 -молярного водноЭго раствора субстрата 1. За ходомгидролиза субстрата ненейтрализованным антитромбином тромбином следятФотометрическим измерением количестнаосвобожденного за 1 мин и-нитроанилина при 405 нм. При этом оказывается, что торможение применяемоготромбина различными количествамицитратовой плазмы пропорциональноэтим копичествам,Предлагаемый способ по сравнениюс изнестным янляется высокочунстнительным и позволяет определять небольшие количества энзимов, ч:оочень важно в клинической практике.20 1099839 19 Та блица 1 Количество освобожденного за 1 мин 1 ЙУИ-единицейтромбина человека или 1 Сп-единицей плазмина человека или 1 НР-трипсина крупного рогатого скота ферментативным путем из субстратов продукта расщепления МН-В , нмоль Субстрат (концентрация 10 4-м.Тромбинчеловека Плаэминчеловека Трипсин крупного рогатогоскота Н -Бз-фе-вал-арг-.с 4.34,7 12,3 18,0 49,5 21,9 21,3 2,4 60,8 33,8 24,8 28,5 14,6 47,3 20,1 26,1 27,5 73,8 65,8 195,5 111,0 33,0 16,2 126,0 86,9 43,8 10 11 196,0 93,5 28,4 25,.3 12 28,5 19,5 13 29,6 14 19,5 95,6 15 16 25,9 0,9 125,0 192,6 28,622,6 26,1 17 0,85 18 19,8 90,5 0,6 19,2 Таблица 2 Количество ферментативно отщепляемого изсубстрата за 1 мин соответствующим 1 И 1 Н-, .единице количеством зкарин-тромбина человека, тромбинкоагуляэы человека и батроксобина п-нитроанилина, нмоль Субстрат (концентрация 1 О 4 -м)Тромбинкоагу- Батрокляза человека собин Экарин-тромбин человекаЫ -Бз-фе-вал-арг-пНА НСЮ 30,7 3,26 102 575 15,81 246,4 ВНИИПИ Заказ 4411/45 Тираж 823 Подписное филиал ППП "Патентф, г. Ужгород, ул.Проектная, 4 116,9 109,0 150,8 126,5 21,7 18,2или общей формулый -гли-про-арг-ИН-В (2) где Н - водород или блокирующаяацильная или сульфанильнаягруппа;В" - замещенный ароматическийуглеводородный остаток;Х - аргинильная или лиэильнаягруппа.35Субстрат может быть протонизован минеральной кислотой, например НСХ НВг, НЯО) или НРО,или органической кислотой, например муравьиной, щавелевой или винной. 40К - ацильная группа может быть изображена частичной формулой В-СО- где й- алифатический углеводородный остаток с 1-17, предпочтительно 1-8, атомами С; аралифатический углеводородный остаток, алифатическая группа которого содержит 1-6 атомов С; циклоалифатический углеводородный остаток; ароматический углеводородный остаток; алкилоксигруппа с 1-17, предпочтительно 1-6, атомами С, или 50 бензилоксигруппа. Н может обозначать нераэветвленную или разветвленную алкильную группу, например метил, этил, пропил, бутил, пентил, гексил, гептил, октил и т.д. до гептадецилау бензильную 2-фенилэтильную, 3-фенилпропильную и т.д. до 11-Фенилундецильной группы; циклогексильную или Фенильную, ж - нафтильную, 1 -нафтильную или бифенильную группу, а такжебенэилоксигруппу. 60В - сульфонильная группа - может представлять собой алкансульфонилгрунну, алкановый остаток которой содержит 1-17, предпочтительно 1-6 атомов С, например метан- или этан 30 Изобретение относится к медицине, а именно биологическим методам иссле дования биологических жидкостей.Известен способ определения тром- бина, плазмпна, трипсина и тромбиноподобных ферментов в биологических 5 жидкостях путем взаимодействия пробы биологической жидкости с субстратом с последующим определением продуктов гидролиза фотометрически, спектрометрически или флюорографически 1.Однако известный способ недоста-. точно чувствителен.Бель изобретения в ,повышение чувствительности способа.Поставленная цель достигается тем,15 что согласно способу определения тромбина, плазмина, трипсина и тромбиноподобных ферментов в биологических жидкостях путем взаимодействия пробы биологической жидкости с субстратом с последующим определением продуктов гидролиза фотометрически, спек трометрически или флюоресцентноспектрофотометрически в качестве субстрата используют вещество общей формулы225В -гли-про-Х-ЫН-В (1) сульфонильную группу или арсульфонильную группу, ароматическое ядро которой может быть замещено одной или несколькими (например, тремя) алкильными группами, например бензолсульфонильную, и-толуолсульфонильную или нафталинсульфонильную группу.2В может представлять собой, например, п-нитрофенильную, 2-нафтильную или 4-метокси-нафтильную группу.Субстрат можно получать различными известными методами, например, согласно одному из них связывают хромофорные группы (Н в формуле 1) с С-концевой аминокислотной группой. Эти группы одновременно имеют функцию С-концевых групп, защищающих карбоксильную группу во время ступенчатого соединения аминокислот при образовании желаемой пептидной цепи. Остальные защитные группы селективно отщепляют от целевого продукта беэ влияния на хромофорную группу.Анализ элюатов и продуктов проводят путем тонкослойной хроматограФии. Для этой цели применяют покрытые гелем двуокиси кремния Ф 254 стеклянные пластинки. Для проявления тонкослойных хроматограмм применяют следующие системы растворителей: хлороформ:метанол 9:1; н-пропанол:этиловый эФир уксусной кислоты, вода 7:1:2; н-бутанол:уксусная кислота; вода 3:1:1.Хроматограммы проявляют сначала в ультрафиолетовом свете и потом нутем реакции с хлором/толуидином.Подгруппа определенных формулой 1 субстратов соответствует веществу, описанному следующей формулой(где В - алкилоксикарбонильная группа, алкилостаток которойсодержит 1-6 атомов С, аралкилоксикарбонилгруппа, алкиленовый остаток которойсодержит 1-6 атомов С, алкансульфонильная группа, алканостаток которой содержит1-6 атомов С, арилсульфонилгруппа, арилостаток которойсодержит в соответствующемслучае заместители, или алкансильная группа, алканостаток которой содержит 1-6атомов С;й - Ь-нитрофенильная, 2-нафтильная или 4-метокси-нафтильная группа.Субстраты этой формулы имеют высокую восприимчивость не только в отношении плаэмина и трипсина, а также и в отношении тромбина и тромбиноподобных энзимов.Н р и м е р 1. К"-Кбо-гли-нро-арг-пНА НСХ; кбо-арг-рНА НСМ.10 В круглодонной трехгорлой колбе емкостью 250 мл растворяют 16,0 г высушенного пятиокисью фосфора кбоарг-Он НСЮ в 90 мл абсолютного ГМПТА (триамид И, И, И, И", И " - гексаметилфосфорной кислоты) без доступа влаги при 20 С. К полученному раствору прибавляют при комнатной температуре сначала раствор 4,74 г триэтиламина в 10 мл ГМПТА и затем 16,4 г п-нитрофенилизоцианата (100-ный избыток) по порциям.После 24 ч при 20 С ГМПТА большей частью отгоняют в вакууме. Остаток экстрагируют неоднократно 30-ной уксусной кислотой. Остаток выбрасы вают.Соединенные экстракты уксусной кислоты для дальнейшей очистки наносят на.уравновешенную 30-ной уксусной кислотой колонку Сефадекс Ги элюируют 30-ной уксусной кислотой, Ту фракцию элюата уксусной кислоты, которую можно расщеплять обработкой трипсином при ос вобождении п-нитроанилина, подвергают сушке вымораживанием. Получают 12,6 г аморфного порошка, который однороден в тонкослойной хроматограм ме в системе растворителей В.Элементный; анализ,: С 51,21 (51,67); Н 5,48 (5,42); И 1792 (18,08); СК 7,50 (7,73)Со Н ИьОСП р и м е р 2. И -Кбо-гли-про 0-арг-пНА НСХ.4,65 г соединения примера 1 обрабатывают 40 мл 2 н. НВг в ледяной уксусной кислоте без доступа влаги при перемешивании в течение 1 ч при 20 С. Пептидное производное при этом растворяется при выделении СО. Реакционный раствор при сильном перемеши ванин прибавляют по каплям к 250 мл абсолютного эфира, причем выпадает (2 НВг) Н-арг-пНА. Эфирную фазу отсасывают, после чего промывают твердую фазу еще 4 раза, применяя по 45 100 мл абсолютного эфира, с целью удаления образовавшегося в качестве побочного продукта бензилбромида, а также избыток НВг и уксусной кислотыПутем сушки в вакууме пластинками 50 ИаОН получают деблокированный продукт с количественным выходом. Сухой (2 НВг) Н-арг-рНА растворяют в 25 мл диметилформалида. К охлажденному до -10 С раствору прибавляют 1,40 мл триэтиламина. Образуется осадок, который отфильтровывают и дополнительно промывают небольшим количеством холодного диметилформамида. К филь- трату прибавляют при -10 С 4,70 гокбо-гли-про-и-нитрофенокси. Через 60 несколько часов температура реакцио онного раствора поднимается до 20 С.о Раствор опять охлаждают до -10 С и буферуют 0,35 мл триэтиламина. Через 16 ч прибавляют еще раз 0,35 мл три этиламина при -10"С, Еще через 24 чконцентрируют реакционный растворв вакууме досуха. Остаток растворяют в50 мл метанола. После прибавления0,8 мл кон".трированной соляной кислоты концентрируют раствор досуха ввакууме при 20 О С, Эту операцию повторяют 3 раза с целью перевода гид; робромида трипептида в гидрохлорид. Сырой гидрохлорид трипептида растворяют в 50 мл метачола и предварительно очищают при помощи фильтрации гелем через колонку Сефадекс ЛХф.Для дальнейшей очистки концентрируют в вакууме ту Фракцию метанола, которую можно расщеплять обработкой трипсином с освобождением и-нитроанилина. Остаток растворяют в 30-ной уксусной кислоте. Раствор очищают путем фильтрации гелем на уравновешенной 30-ной уксусной кислотойколонке Сефацекс Г. Ту фракцию элюата уксусной кислоты, которую можно расщеплять обработкой трипсином с освобождением и-нитроанилина, поспе прибавления 0,80 мл концентрированной соляной кислоты подвергают сушке вымораживанием. Получа ют 3,64 г (58,8 от теоретического) аморфного легкого порошка, который однороден в тонкослойной хроматограмме в системе растворителей В.Элементный анализ,: С 52,09 (52,38) у Н 5,83 (5,70) р И 18,33 (18,10)р СХ 5,75 (5,73).О;СМАнализ дает аминокислоты в правильном соотношении: арг: 0,96-гли: :1,00-про:0,96,Г р и м е р 3. Н-Гли-про -арг- -пНА 2 НС 2.61,91 г полученного по примеру 2 соедннечия без доступа влаги обрабатывают 300 мл 3 н.соляной кислоты в ледяной уксусной кислоте с перемешиванием в течение 2 ч при 35 СПептидное производное при этом растворяется при выделении СО.Реакционный раствор при сильном перемешивании прибавляют по каплям к 2 л абсолютного эфира, причем выпадает Н-гли-про-арг-пнНСХ в виде хлопьев. Эфирную фазу отсасывают, после чего промывают твердую фазу еще 4 раза, применял по О, 5 л абсолютного эФира, с целью удаления образовавш,.гося в качестве продукта расщепления бензнлхлорида и избытка соляной и уксусной кислот.Путем сушки в вакууме плитками ИаОН получают деблокированный продукт с количественным выходом. Для дальнейшей очистки растворяют высушенный продукт в 900 мл 30-ной уксусной кислоты. Раствор очищают путем Фильтрации гелем на уравновешенной 30-ной уксусной кислотой колонке фСефадекс Г. При этомразделяют злюат уксусной кислотына 2 фракции, которые обе можно расщеплять обработкой трипсином с освобождением п-нитроанилина.Главная фракция содержит желаемыйпродукт, а побочная фракция - исходный материал. После прибавления8 мл концентрированной соляной кислоты к главной фракции ее подвергаютсушке вымораживанием.Получают 43,5 г аморфного порошка,)1который однороден в тонкослойной хро-.матограмме в системе растворителей В,Элементный анализ,Ъ: С 43,38(21,49); СК 13,41 (13,60),СНо И 80 с С 2П р и м е р 4. 2,09 г полученногосоединения из примера 3 растворяют в25 мл диметилформамида. Послеохлаждения до -10 С прибавляют555 мкл триэтиламина и непосредствен 20но после этого 1,13 г п-нитрофенилового эфира фенилуксусной кислоты.Реакционный продукт обрабатывают, какописано выше.Очистка. Фильтрацию гелем осущест вляют на уравновешенной 30-ной уксусной кислотой колонке Сефадекс Г Ту фракцию элюата уксусной кислоты,которую можно расщеплять обработкойтрипсином с освобождением и-нитроани лина, после прибавления 320 мкл концентрированной соляной кислоты подвергают сушке вымораживанием,Выход 1,99 г (82,5 от теоретического) аморфного порошка, которыйоднороден в тонкослойной хроматограм- "ме в системе растворителей В.Элементный анализ,Ъ: С 54,06-гли-про-арг-пНА.НСХ.2,09 г полученного по примеру 3 соединения растворяют в 25 мл диметил. формамида. После охлаждения до -10 ОС прибавляют 555 мкл триэтиламина и после этого 1,19 г и-нитрофенилового эфира 3-фенилпропионовой кислоты 50 (т.пл. 97-98,5 С). Продукт реакции обрабатывают, как описано выше. Филь трацию гелем осуществляют на уравновешенной 30-ной уксусной кислотной колонке Сефадекс Г. Фракцию элюата уксусной кислоты, которую можно расщеплять обработкой трипсино(л с выделением п-нитроанилина, после при бавления 320 мкл концентрированной соляной кислоты подвергают сушке вымораживанием.6 ОВыход 2,06 г (83,5 от теоретического) аморфного порошка, который од:" нороден в тонкослойной хроматограмме в системе растворителей В. Элементный анализ,Ъ: С 54.25(18, 16) ) С 1 5, 63 (5,75) .Су Е( И 8 ОСХМП р и м е р б. И -Циклогексилкарбонил-гли-про-арг-пНА НС 1,2,09 г полученного по примеру 3соединения растворяют в 25 мл диметилформамида. После охлаждения до-10 С прибавляют 555 мкл триэтиламина и после этого 1,10 г и-нитрофенилового эфира циклогексикарбонсвойкислоты. Продукт реакции обрабатывают дальше, как описано выше.Фильтрацию гелем осуществляют науравновешенном 30-ной уксусной кислотой колонке Сефадекс Г.Фракцию элюата уксусной кислоты,можно расщеплять обработкой трипсином с освобождением п-нитроанилина,после прибавления 320 мкл концентрированной соляной кислоты подвергают сушке вымораживанием.Выход 1,87 г (78,6 от теоретического) аморфного порошка, который однороден в тонкослойной хроматограммев системе растворителей В.Элементный анализ,Ъ: С 52,70-про-арг-пНА НС 1.2,09 г полученного по примеру 3соединения растворяют в 25 мл риметилформамида. После охлаждения дов 10 прибавляют 555 мкл триэтиламина и непосредственно после этого117 г и-нитрофенилового эфира .каприловой кислоты. Реакционныйпродукт обрабатывают, как описановыше.Фильтрование гелем осуществляютна уравновешенной 30-ной уксуснойкислотой колонке Сефадекс Г.Фракцию элюата уксусной кислоты, ко"торую можно расщеплять путем обработки трипсином с освобождением и-нитроанилина, после прибавления320 мкл концентрированной солянойкислоты подвергают сушке вымораживанием.Выход 1,99 г (81,4 от теоретического) аморфного порошка, которыйоднороден в тонкослойной хроматограмме в системе растворителей В.Элементный анализ,Ъ: С 52,84,18,34 С 7 5,73 (5,80).СД Н 4 И 8 О 6 СХП р и м е р 8. И -Моэ-гли-про-арг-пРА Н 22,09 г полученного по примеру 3соединения растворяют в 25 мл диметилформамида. После охлаждения додукт реакции перерабатывают дальше,как описано выше. Фильтрование гелем осуществляют на уравновешенной30-ной уксусной кислотой колонкеСефадекс Г. Фракцию элюатауксусной кислоты, которую можнорасщеплять обработкой трипсином сосвобождением п-нитроанилина, послеприбавления 320 мкл концентрированной соляной кислоты подвергают сушке вымораживанием.Выход 2,17 г (84,9 от теоретического) аморфного порошка, которыйоднороден в тонкослойной хроматограмме в системе растнорителей В.Элементный анализ,: С 48,50(5,55),0 15 С 6 Н И 807 ЯС 1П р и м е р 9. М -БензолсульКфонил-гли-про-арг-пНА НС 12,09 г полученного по примеру 3 соединения растворяют в 25 мл диметилформамида. После охлаждения до -10 С прибавляют 555 мкл триэтилами. 25 на и после этого 780 мг хлорангидрида бензолсульфононой кислоты. 2,09 г полученного по примеру 3 соединения растворяют в 25 мл диметилформамида. После охлаждения до -10 С прибавляют 555 мкл триэтиламина и после этого 345 мкл хлорангидри да метансульфоновой кислоты. Продукт реакции обрабатывают дальше, как описано выше.Фильтрование гелем осуществляют на уравновешенной 30-ной уксусной кислотой колонке Сефадекс Г. Фракцию элюата уксусной кислоты, 60 которую можно расщеплять обработкой трипсином с освобождением п-нитроани. лина, после прибавления 320 мкл концентрированной соляной кислоты подвергают сушке вымораживанием. Продукт реакции перерабатывают дальше, как описано выше. Фильтрование гелем осуществляют на уравновешенной 30-ной уксусной кислотой колонке Сефадекс Г. Фракцию элюата уксусной кислоты, которую можно расщеплять обработкой трипсином с освобождением п-нитроанилина, после прибавления 320 мкл концентрированной соляной кислоты подвергают сушке нымораживанием.Выход 1,95 г (78 от теоретического) аморфного порошка, который 40 однороден в тонкослойной хроматограмме в системе растворителей В.Элементный анализ, : С 47,79 (48,03); Н 5,40 (5,32); И 18,11 (17,93); Я 5,06 (5,13); СХ 5,61(5,67)45СН, Я 8 О,ЯС.П р и м е р 10. Н -Метансульфонил-гли-про-арг-пНА НСЫ,Выход 1,70 г (75,5 от теоретического) аморфного порошка, которыйоднороден в тонкослойной хроматограмме н сис-еме растворителейЭлементньй анализ,: С 42,88(6, 30),СНМ О,ЯСЫП р и м е р 11. И -2-Нафталинсульфонил-гли-про-арг-пНА НСЫ.2,09 г полученного по примеру 3соединения растворяют в 25 млдиметилформамида. После охлаждениядо -10 С прибавляют 555 мкл триэтилОамина и после этого 1,0 г хлорангидрида нафталин -2-сульфоновой кислотыПродукт реакции обрабатывают, какописано выше.Фильтрование гелем осуществляютна уравновешенной 30-ной уксусйойкислотой колонке Сафадекс Г.Фракцию элюата уксусной кислоты, которую можно расщеплять обработкойтрипсином с освобождением п-нитроанилина, после прибавления 320 мкл концентрированной соляной кислоты подвергают сушке вымораживанием.Выход, 1,81 г (66,8 от теоретического) аморфного порошка, который однороден в тонкослойной хроматограмме в системе растворителей В.Элементный анализ,: С 51,88(5,25),С, Н ИзО БС 2П р и м е р 12. И-Изобутилоксикарбонил-гли-про-арг-пНА НСЫ.2,09 г полученного по примеру 3 соединения растворяют в 25 мл диметилформамида. После охлаждения до -10 С прибанляют 555 мкл триэтиламина и после этого 650 мкл изобутило-ного эфира хлормураньиной кислоты. Реакционный продукт перерабатыгают дальше, как бписано ньше. Фильтрование гелем осуществляют на уравновешенной 30-ной уксусной .кислотой колонке Сефадекс Г Фракцию элюата уксусной кислоты, которую можно расщеплять обработкой трипсином с освобождением и-нитроанилина, после прибавления 320 мкл концентрированной соляной кислоты подвергают сушке вымораживанием.Выход 1,71 (73,1 от теоретического) аморфного порошка, который однороден в тонкослойной хроматограмме в системе растворителей В.Элементный анализ,: С 49,06 (49,27); Н 6,42 (6,37); М 19,33 (19, 15); СЙ 5, 98 (б, 06) .Сл Н ХОу С 1П р и м е р 13. Н-Кбо-гли-про-арг-НА НС 2; И-кбо-арг (ИО ) -2-НА..1099839 3,53 г хорошо высушенного кбо-арг (ИО)-ОН без доступа влаги растворяют в 150 мл тетрагидрофурана/диметилформамида (3:1). После охлаждения до -10 С к раствору прибавляют 1,39 мл триэтиламина и потом по капг лям в течение 15 мин раствор 1,35 г изобутилового эфира хлормуравьиной кислоты в 20 мл тетрагидрофурана, причем температуру выдерживают от -10 до -5 С, К полученному раствору "0и йзатем прибавляют по каплям раствор 1,72 г п-нафтиламина в 15 мл тетрагидрофурана, причем поддерживают указанную температуру. Реакционную смесь составляют стоять н течение15 24 ч при комнатной температуре. После отгонки растворителя в вакууме промывают остаток подряд три раза дистиллированной водой, три раза 5 Ъ-ным раствором гидрогенкарбоната20 натрия и опять три раза дистиллированной водой. После сушки н вакууме растворяют сырой продукт в метаноле и хроматографируют через ураннонешенную метанолом колонку Сефадекс ЛХ Из одной фракции элюата получают 3,75 г кристаллическогоЖсоединения И -кбо-арг-(ИО) -2-НА (78,4 от теоретического) с т.пл.173-174,5 С, которое однородно н тонкослойной хроматограмме в систе-. З 0 мах растворителей А и Б.Элементный анализ,Ъ: С 60,82 (60,24); Н 5,63(5,48); И 17,48 ,(16,72) . Я )СН .ИО,П р и м е р 14. Н-арг-НА НСХ.957 мг соединения И -кбо-арг(ИО) в 2- -НА навешивают в реакционном сосуде аппарата Сакакибара. 15 мл высушенного фтористоводородного газа конденсируют в реакционном сосуде. После реакции через 1 ч при 0 С при перемешивании отщепляют нитрозащитную группу аргинина, а также карбобензоксигруппу. Конденсированный фтористонодородный газ отгоняют в вакууме из реакционной смеси и остаток растворяют в диметилформамиде. Для перевода производного аминокислоты н солянокислую соль прибавляют 0,5 мл концентрированной соляной кислоты и раствор концентрируют досуха. После днукратного повторения . этого процесса растворяют остаток в 50 мл 40-ной уксусной кислоты. Дляочистки наносят раствор уксусной кислоты на уравновешенную 30-ной уксусной кислотой колонку Сефадекс Ги элюируют 30-ной уксусной кислотой. Фракцию элюата, которую можно 60 расщеплять обработкой трипсином с освобождением п-нитроанилина, после прибавления 320 мкл концентрированной соляной кислоты подвергают сушке вымораживанием. Выход 473 мг (63,5 от теоретического) аморфного порошка, которыйоднороден в тонкослойной хроматограмме н системе растворителей В.Элементный анализ, Ъ:С 51, 82 (51, 62); Н 6, 18 (б, 23);И 17, 08 (18, 81); С 1 18, 75 (19, 05) .С.Н,1 И,ОСУ,П р и м е р 15, И-Кбо- гли-про.арг-НА НС 1372 мг соединения по примеру 14подвергают взаимодействию с 470 мгкбо-гли-гро-ОпНП, получая соединенияИ -кбо-гли-арг-НА НС 1. Фильтронанигелем осуществляют на уравновешеннойуксусной кислотой колонке СефадексГ. Фракцию элюата уксусной кислоты, которую можно расщеплять обработкой трипсином с освобождением инафтиламина, после прибавления80 мкл концентрированной со 1 яной кислоты подвергают сушке ныморажинанием.Выход 425 мг (68,1 от теоретического) аморфного порошка, который однброден н тонкослойной хроматограммев системе растворителей В,Элементный анализ,Ъ; С 60,11(15,71); .СУ 5, 59 (5, 68) .С 1 Нз ИуОСХП р и м е р 1 о. И -Гли-про-арг - 2-НАНС 1,.625 мг соединения И -кбо-гли-про-арг-НА НС 1: деблокируют, как описано выше, и растворяют в 8 мл диметилформамида. После охлаждениядо -10 С прибавляют 140 мкл триэтилоамина и после этого 210 мг хлорангидрида и-толуолсульфононой кислоты(т.пл.67-69"С). Реакционный продукт обрабатывают известными приемами. Фильтрование гелем осуществляют на уравнонешенной 30-ной уксусной кислотой колонке Сефадекс Г. Фракцию элюата уксусной кислоты, которую можно расщеплять обработкой трипсином с освобождением (3 -нафтиламина, после прибавления 80 мкл концентрированной соляной кислоты подвергают сушке вымораживанием. Выход 500 мг аморфного порошка.Элементный анализ,: С 56,13 (55,93); Н 5,86 (5,95); И 15,48 (15,2)," Б 5,07 (4,98); Сй 5,39 (5,50) .П р и м е р 17. И-Кбо-гли-про-арг-МеО-НА НСУ; И -кбо-аргК(ИО) -4-Ме 0-2-НА.3, 53 г кбо-арг(ИО ) -ОН согласно примеру 13 подвергают взаимодейстнию с 2,17 г 4-метокси-нафтиламина и перерабатывают, как описано в этом примере. Фильтрование гелем осущестнляют на уранновешенной метанолом колонке Сефадекс ЛХ 20.Из одной Фракции элюата получают 3,35 г (65,9 ст теоретического)-4-МеО-НА подвергают взаимодействию получая соединение Н-арг-МеО- -НАф 2 НСР.Фильтрование гелем осуществляют на уравновешеннсй 30-ной уксусной 15 кислоой колонке Сефадекс Г. Фракцию элюата уксусной кислоты, которую можно расщеплять обработкой трипсином с освобождением 4-метокси- -2-нафтиламина, после прибавления 320 мкл концентрированной соляной кислоты подвергают сушке вьтораживанием.Выход 570 мг (71,0 от теоретического) аморфного порошка, который однороден в тонкослойной хромато грамме в системе растворителей В.Элементный анализ,: С 51,08(17,45); С 2 17,55 (17,67).С, Н,О,СЫ30П р и м е р 19, 402 мг соединения Н-арг-МеО-НА НСР подвергают взаимодействию с 470 мг кбо-гли-про- -ОпНП, получая соединение И -кбо-гли-про-арг-МеО-НА НСР.Фильтрование гелем осуществляют на уравновешенной 30-ной уксусной кислотой колонке Сефадекс Г. Фракцию элюата уксусной кислоты, которую можно расщеплять обработкой 40 трипсином с освобождением 4-метокси-нафтиламина, после прибавления 80 мкл концентрированной соляной кислоты подвергают сушке вымораживанием.Выход 493 мг (75,4 от теоретического) аморфного порошка, который однороден в тонкослойной хроматограмме в системе растворителей В.Элементный анализ,: С 59,01 (58,75); Н 6,10 (6,16); Ы 15,19 ,50 (14,99)С 1 5,35 (5,42) .П р и м е р 20, 655 мг соединения Ф-кбо-гли-про-арг-МеО-НА 55 НСР деблокируют и растворяют в 80 мл диметилформалина. После охлаждения до -10 ОС прибавляют 140 мкл триэтила.ина и после этого 210 мг хлорангидрида и-толуолсульфоновой кислоты. Продукт реакции перерабатывают даль ше. Фильтрование гелем осуществляют на уравновешенной 30-ной уксусной кислотой колонке Сефадекс Г. Фракцию элюата уксусной кислоты, которую можно расщеплять обработкой 65 трипсином с освобождением 4-метокси-нафтиламина, после прибавления80 мкл концентрированной соляной кислоты подвергают сушке вымораживанием,Выход 465 мг (69,4 от теоретического) аморфного порошка, которыйоднороден в тонкослойной хроматограмме в системе растворителей В.Элементный анализ,: С 55,7 5(5,26) .Н М О БСР.П р и м е р 21. И -Моз-гли-пролиз-пНА НСР;М-БОК-И -кбо-лиз-пНА.т Е19,0 г соединения И"-БОК-И-кбо-лиэ-ОН растворяют в 100 мл ГМПТА иприбавляют 5,06 г триэтиламина и потом 16,4 г п-нитрофенилизоцианата.По истечении 24 ч реакционный раствор с перемешиванием прибавляютпо каплям к 1 л 2-ного растворагидрогенкарбоната натрия. Осажден-.ный продукт отфильтровывают и промывают трижды по 0,5 л 2-ного раствора гидрогенкарбоната натрия, трижды по 0,5 л дистиллированной воды,трижды по 0,5 л 0,5 н. соляной кислоты и трижды по 0,5 л дистиллированной воды. Полученный продукт высуши-.овают в вакууме при 40 С и после этого зкстрагируют дважды, применяяпо 30 мл нагретого до 70 С диметилФормамида, причем желаемый продуктполностью растворяется, в то времякак побочный продукт, БИ -бис-и-яитрофенилмочевина, остается в нерастворенном виде. Раствор диметилформамида конц нтрируют в вакууме при 40 С.Остаток растворяют в метаноле ипутем фильтрования гелем через урав Фновешенную метанолом колонку СеФадекс ЛХполучают 18,85 (75,3от теоретического) кристаллическогосоединения И"-БОК-Ф-кбо-лиз-пНАс т.пл. 125-125,5 С, которое однородно в тонкослойной хроматограмме всистемах растворителей А и В.Элементный анализ,: С 60,49(11,19).С НИ,О,П р и м е р 22. И -Моз-гли-про-лиз Г-кбо) -пНА.4ю 61, 5 г соединения И -БОК-И -кбо-лиз-пНА обрабатывают, перемешивая1 ч при 20 С, 20 мл трифторуксуснойкислоты без доступа влаги, причемпроизводное аминокислоты растворяет"ся с выделением СО. Реакционныйраствор при сильном перемешиваниимедленно прибавляют по каплям к150 мл высушенного эфира, причемвыпадает Н-лиз (Г-кбо)-пНА трифторацетат, Эфирную фазу отсасываютфильтровальной палкой. Оставшийсяосадок промывают еще 4 раза, применяя по 50 мл сухого эфира для удаления избыточной трифторуксусной кислоты. Сушкой в вакууме плиткамиедкого натра получают деблокиронанный продукт с количественным выходом. Сухой триФторацетат произнодного аминокислоты растворяют н 15 млдиметилформамида. После охлаждениядо -10 С прибавляют к раствору415 мкл триэтиламина для освобожде- гОния произнодного аминокислоты изтрифторацетата. К реакционной смесиприбавляют 1,48 г моз-гли-про-ОпНП,Продукт реакции перерабатываютдальше, как описано выше. Фильтрование гелем осуществляют на уравновешенной метанолом колонке СефадексЛХ,Выход 1,77 г (83,2% от теоретического) аморфного вещества, котороеоднородно в тонкослойной хроматограмме и системах растворителей А иБ.и,П р и м е р 23. М -Моз-гли-про-лиз-пНАНС 1. 251,42 г соединения И-моз-глипро-лиз(Е-кбо) -пНА деблокируют.Фильтрование гелем осущестнляют науравновешенной 30-ной уксусной кио.летой колонке Сефадекс Г,Фракцию элюата уксусной кислоты,.оторую можно расщеплять обработкойтрипсином с освобождением и-, нитроанилина, после прибавления 160 мклконцентрированной соляной кислотыподвергают сушке вымораживанием.Выход 1040 мг (85,1% от теорети ческого) аморфното порошка, которыйоднороден в тонкослойной хроматограгме в системе растворителей В.П р и м е р 24. Ч -ИзобутоксиЮ,карбонил-гли-про-лиз - гНА НС 1 ИБОК-гли-про-лиз-(Е-кбо)-иНА.20 г соединения И -БОК-И -кбоМ, Е-лиз-(е-кбо)-11 НА деблокируют и раст-.воряют н 20 мл диметилформамида.После охлаждения до -10 С к растворуприбавляют 555 мкл триэтиламина ипосле этого 1,73 г БОК-гли-про-О НП,Реакционный продукт перерабатывают,как описано выше. Фильтрование гелемосущестнляют на уравновешенной мета-нолом колонке Сефадекс ЛХ.Выход 2,20 г (84,0 от теоретического)аморфного вещества, которое однородно н тонкослойной хроматограмме н системах растворителей А и Б. П р и м е р 25.)г -Изобутоксикарбонил-гли-про-лиз И-кбо) -л НА.1,31 г соединения г(" -БОК-гли-про-лиз(Я-кбо) -ггНА деблокируют и растворяют в 12 мл диметилформамида. После охлаждения до -10 аС к раствору при-. бавлягэт 280 мкл тризтиламина и после этого 285 мкл изобутилоного эфира хлормуравьиной кислоты. Продукт 65 реакции обрабатывают, как описано ныше, Фильтрование гелем осуществляютна уравновешенной метанолом колонкеСефадекс ЛХ.Выход 1,15 г (87,8 от теоретического)аморфного вещества, которое однородно и тонкослойной хроматограммев системах растворителей А и Б.П р и м е р 26.гг -Изобутоксикарй,бонил-гли-про-лиз-иНА НСХ.660 мг соединения М -изобутоксикарбонил-гли-про-лиз(Е-кбо)-гНАдеблокируют. Фильтронание гелем осущестнляют на ураннонешенной 30-нойуксусной кислоты колонке СефадексГ, Фракцию элюата уксусной кислоты, которую можно расщеплять обработкой трипсином с освобождением пнитроанилина, после прибавления80 мкл концентрированной соляной кислоты подвергают сушке вымораживанием.Выход 430 мг (77,2 от теоретического)аморфного порошка, который однороден и тонкослойной хроматограмМев системе растворителей В.П р и м е р 27, Ф-Моз-гли-про-лиз-НА НСХ; И" -БОК-)гкбо-лиз-НА1,90 г соединения М-БОК-М в кбо-лиз-ОН поднер,ают взаимодействию,как указано при получении Ы -кбо-арг-(ИО 2)-2-НА, получая соединенияН -БОК-И-кбо-лиз-НА.Фильтрование гелем осуществляютна уравнонешенной метанолом колонке-лиз - 2-НА деблокируют, как указано при потгучении г(" -моз-гли-пролиз-(Е -кбо)-ггНА и растворяют в20 мл диметилформамида. После охлаждения до -10 С к раствору прибавляют 280 мкл триэтиламина и непосредственно после этого 985 мг моз-гли-про-ОггНП. Продукт реакции перерабатывают дальше как указано выгае,Фильтрование гелем осущестнляютна уравновешенной метанолом колонке-лиз (с-кбо) -2-НА деблокируют, какуказано выше.Фильтрование гелем осуществляют на уравновешенной 30-ной уксусной кислотой колонке Сефадекс Г. Фракцию элюата уксусной кислоты, которую можно расщеплять обработкой трипсином с освобождением 2-нафтил 099839амина, после прибавления 80 мкл концентрированной соляной кислоты подвергают сушке нымораживанием.Выход 470 мг (76,36 от теоретического)аморфного порошка, который одно;роден в тонкослойной хроматограммев системе растворителей В.П р и м е р 30, И -Моз-гли-про-лив,-4-Ме 0-2 НА НСР;-БОК- Й 6-кбоК-лиз-ОН подвергают взаимодействиюс1,22 г 4-метокси-нафтиламина согласно примеру 13.Фильтрование гелем осуществляютна уравновешенной метанолом колонке 15Сефадекс ЛХ.Выход 1,82 г (168,06 от теоретического) аморфного соединения, которое однородно в тонкослойной хроматограмме н системах растворителей.П р и м е р 31.)( -Моз-гли в про-лиз (Е-кбо) "4-Ме 0-2-НА.1,07 г соединения-БОК- ВР-кбо-,-лиз-МеО-НА деблокируют согласнопримеру 18 и рас гворяют в 20 мл диметилформамида. После охлаждения до- 10 С к раствору прибавляют 280 мклтриэтиламина и после этого 985 мгмоз-гли-про-ОоНБ. Реакционн;,й продуктперерабатывают согласно примеру 1.фильтрование гелем осуществляют 30на уравногешенной метанолом колонкеСефадекс ЛХ.Выход 895 мг (60,26 от теоретического) аморфного вещества, котороеоднородно в тоцкослойной хроматограм ме в системах растворителей.П р и м е р 32.-Моз-гли-про-лиз-МеО-НА НСЫ.745 мг соединения по гримеру 31деблокируют, как указано выше, Фильтрование гелем осуществляют на уравновешенной 306-ной уксусной кислотойколонке Сефадекс Г. Фракциюэлюата уксусной кислоты, которуюможно расщеплять обработкой трипсиномс освобождением 4-метокси-нафтиламина, после прибавления 80 мкл концентрированной соляной кислоты подвергают сушке выморажинанием.Выход 470 мг (72,76 от теоретического) аморфного порошка, который однороден в тонкослойной хроматограмме в системе растворителей В.Субстраты формулы 1 пригодны дляопределения энзимов, расщепляющихпептидные цепи на карбоксильной стороне как аргинина, так и лизина.К этой группе энзимов относятся тром.бчн и тромбиноподобные энзимы, экари.тромбин, плазмин и трипсин. При помощи субстратов можно также опреде" б 0лять проэнзимы, например протромбин,плазмицоген и трипсиноген, активаторыи ингибиторы энзимов, напримерантитромбины, в частности софакторгепарина (антитромбин 111) и гепарин далес. антиплазмиц ; -макроглобулцц,ингибиторы трипсица (ь.-антитрипсин),апротициц, ингибиторы трипсина соевых бобов и ингибиторы плазмина.При полн л актинировании проэнзи-мов активаторами или слесями активаторов образуется эквивалентное количе:.тво энзима, которое можно измерять.Измерение концентрации активаторовпроводят таким образом, что определяют скорость образования энзимаиз проэцзима. Эта скорость пропорциональна концентрации активатора.П р и м е р 33, Субстрат, например-кбо-гли-про-арг- НА НСР, при"меняют для определения различных энзимов в плазме крови.Определение основывается на.томпринципе, что образонанный ферментативным гидролизом субстрата продуктРасщепления ИН 2-В 2 имеет уф-спектргкоторый отличается от уф -спектра, субстрата и смещен в направлении большихдлин волн. Так субстрат " -кбо-гли-про-арг-РНА НСР имеет максимум поглощения при 302 цм и молярный коэффициент экстинкции 12920. Поглощение субстрата при 405 нм практическиравно О.Образованный при ферментативномгидролизе субстрата продукт расщепления ИН Я т.е, п-нитроанилиц, имеетмаксимум йоглощеция 380 нм и молярныйко: ффициент экстицкции 13200. При405 цм коэффициент экстинкции малопонижается, т.е. до 9650, Путемспектрофотометрического измеренияпри 405 нм можно легко определятьстепень фермецтативного гидролизасубстрата, которая пропорциональнаколичеству о=щепленного и-нитроанилина,Имеющийся в избытке субстрат цемешает измерению при 405 нм. Спектрофотометрическое измерение но всехслуча"х проводят при 405 цм,Повышенная водорастворимость соединения обеспечивает определениеэцзимон в более широких пределахконцентрации. Это важно при стандартных способах исследования, так какв этих случаях можно точно определятькрайние величины, без предварительного разбавления или концентрированиябиологических проб.Измерения проводят следующимобразом. 0,25 мл раствора энзима(0,56 М 1 Н/мл тромбина человека, О, 28 1(7 Н/м экарин-тромбина человека 1,05 И 7 Н/мл стафило-тромбина чело века, 4,0 И,1 Н/мл батроксобина, 0,4 СП/мл плазмица человека и 1,8 )Р/мл трипсина крупного рогатого скота) прибанляют к 2,0 мл буфера трисимидазола (рН, ионна" сила 0,15) . Смесь инкубируют в течение ,2 мин при 37 С. Потом к смеси при