Способ разделения мононуклеарных фагоцитов на субпопуляции

(50 4 С О 1 И 1 ст ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ ЕЛЕНИЯ МОНОНУКЛЕАРСУБПОПУЛЯЦИИ относится к област но к иммунологии и изобретения - повырепарата. Получают перитонеального эк(54) СПОСОБ РАЗД НЪХ ФАГОЦИТОВ НА (57) Изобретени медицины, а име цитологии. Цель шение качества суспензию клето ГОСУДАРСТ 8 ЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ(56) СашЬе 11 ей а 1. А 11 оГ 1 тптпттпо 1 о 8 у, 1978, т. 38, р94 в 1.Авторское свидетельство СССР1179223, кл. С 01 Н 1/28, 1983. судата от интактных мышей. На культуральных чашках, покрытых альбумином,производят адгезию полученных клетокв среде 199 с НЕРЕЯ-буфером. Неприлипшие клетки переносят на другиечашки, покрытые альбумином в концентрации 1 мг/мл, адгезируют полученныеклетки. Затем неприлипшие клетки переносят на третьи чашки, покрытие альбумином в концентрации 2 мг/мл, и адгезируют. Все три чашки инкубируют ссывороткой рогатого скота и чашки отмывают до лимфоцитов. Во всех трех чашках определяют число клеток, интенсивность фагоцитоза и секрецию лиэоцима.По количеству клеток в различных,чашках выделяют популяции секретирующихклеток, неактивных и фагоцитирующих клеток, 2 табл.Изобретение относится к медицине,а именно к иммунопогии и цитологии.Целью изобретения является повышение качества препарата за счет того,что исходную суспензию клеток после.довательно инкубируют на полистироловых чашках, предварительно обработанных альбумином, и инкубирование проводят прй рН среды 7,0-7,1 в градиентеконцентраций альбумина 0,1 в 2 мг/мло,при 12 , либо в градиенте температуры 12, 20, 37 С при концентрации альбумина 2 мг/мл, причем субпопуляциимононуклеарных фагоцитов (МНФ) получают в виде монослоя.П р и м е р 1. Разделение резидентных перитонеальных макрофагов.Получают суспензию клеток перитонеального экссудата от 20 - 25 интактных мышей самцов линии Г (СВА х С 57 В 1.) весом 20-25 г. На культуральных чашках из полистирола, предварительно покрытых альбумином (концент рация альбумина в среде прединкубации чашек 2 мг/мл), производят адгеэию полученных клеток в культуральной среде 199 с 10 мМ НЕРЕЯ буфера приарН 7,0 при 12 С в течение 30 мин. За- З 0 тем неприлипшие клетки переносят надругие чашки, предварительно покрытые альбумином в более низкой концено трации (1 мг/мл) для адгезии при 12 С в течение 30 мин. Затем суспензию35 клеток, не прилипших при концентрации альбумина 1 мг/мл, переносят на новые чашки, покрытые альбумином, в концентрации 0,1 мг/мл, и проводят адгезию также при 12 С в течение 30 мин,оНа последнем этапе все полученные в виде монослоев субпопуляции инкуби -оруют (37 С) с 57.-ной сывороткой рогатого скота и тщательно отмывают для удаления лимфоцитов. Для каждой из субпопуляций перитонеальных макроФагов определяют следующие показатели: число клеток, интенсивность фаго- . цитоэа опсонизированных эритроцитов барана (ЭБ) через Гс-рецепторы одноф 50 го из ключевых способов фагоцитоза и элиминирования макрофагами чужеродных объектов, бактерий и др.; секрецию лизоцима, разрушающего клеточные стенки бактерий, обеспечивающего бактерицидную активность сыворотки крови, секрецию-галактозидазы, одного из ключевых лизоСомальных ферментов, участвующих в переваривании и лизисе микроорганизмов. Полученныеданные представлены в табл. 1,П р и м е р 2. Разделение перитонеальных макрофагов.Получают суспензию клеток перитонеального экссудата от 20-25 интактных мышей. На культуральных чашкахиз полистирола, предварительно покрытых альбумином в концентрации0,1 мг/мл, производят адгезию полученных клеток в среде 199 с 11 мМНЕРЕЯ буфера при рН 7,1 при 12 С втечение 30 мин. Затем неприлипшиеклетки переносят на другие чашки, предварительно покрытые альбумином вконцентрации 1 мг/мл, производят ад)гезию полученных клеток в среде 199с 11 мМ НЕРЕЯ буфера при рН 7,1 прио12 С в течение 30 мин. Затем неприлипшие клетки переносят на третьичашки, предварительно покрытые альбумином в концентрации 2 мг/мл, производят адгезию, Далее все три чашоки инкубируют при 37 С с 57-ной сывороткой рогатого скота, после чегочашки отмывают от лимфоцитов. Вовсех трех чашках определяют числоклеток, интенсивность фагоцитоза,секрецию лизоцима и по количествуклеток в чашке с 0,1 мл/мл альбуминавыделяют популяцию секретирующих клеток, а по количеству клеток в чашке с 1 мл/мл альбумина выделяют новпуляцию неактивных клеток, а в чашкес 2 мг/мл выделяют популяцию Фагоци -тирующих клеток (см. табл.1).В табл, 2 дано сравнение различийпо биохимическим параметрам междуФракциями, полученными по известномуи предложенному способам.Сравнительные данные табл. 2 сви 1 детельствуют об улучшении разделения по биохимическим параметрам, т.е. о большей чистоте получаемых субпопуляций,Формула изобретенияСпособ разделения мононуклеарных фагоцитов на субпопуляции путем инкубации в среде 199 на белковом суб- . страте с последующим учетом клеток, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что,с целью повьппения качества препарата при разделении клеток на фагоцитирующие, неактивные и секретирующие фагоциты, среда дополнительно содержит1307284 4ем концентрации альбумина от 0,1 до 2 мг/мл, при концентрации альбумина 0,1 мг/мл выделяют популяцию секретирующих клеток, а при концентрации альбумина 1 мг/мл выделяют популяцию неактивных клеток и при концентрации альбумина 2 мг/мл вьщеляют популяцию фагоцитирующих клеток.Таблица 1 НЕРЕБ-буфер р Н 7, 0-7, 1 при следующихсоотношениях, компонентов, мас.Е:НЕРЕЯ-буфер 10-11Среда 199 Остальное 5 а в качестве белкового субстрата используют альбумин, при этом инкубацию проводят с постепенным увеличениКонцентрация Фагоциты, Интенсивность Интенсивность Выделенныеальбумина, 7 фагоцитов секреции популяциимг/мл 0,6+ 0,1 1,2+ 0,8 0,1 Секретирующиеклетки 19+ 8 0,5+ 0,2 О,бф 0,4 Неактивныеклетки 52 ф 12 2,3 ф О,б 0,2+ 0,1 фагоцитирующиеклетки Таблица 2 Активность лактат- Активность цитодегидрогеназы, хромоксидазы,мФЕ/10 МНФ мФЕ/10 МНФ Субпопуляция,9(С)Активность глю- козо-б-фосфат-дегидрогеназы, мФЕ/10 МНФ Известный способ (разделение на ФТС) 1 (4) 1,17/0,60= 1,9 раэ4,88/1,98=- 2,4 раэ Предлагаемый способ (разделение на альбумин) Пример 1Составитель М. ПознякТехред В.Кадар Корректор А, Обручар Редактор Н, Швьщкая Заказ 1622/40 Тираж 777ВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб д, 4/5 Подписное Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 2 (20) 3 (37) 1 э 16+ Оэ 18 0,45+ Оэ 08 0120 + Оэ 12 0,88+ Оф 32 276+ Оэ 56 5,57 + 0,95