Способ получения пектина

АНИЕ ИЗОБРЕТ ОПИС К ПАТЕНТУ Комитет Российской Федерации по патентам и товарным знакам(71) Пятигорский фармацевтический институт(73) Пятигорский фармацевтический институт(34) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕКТИНА(57) Использование: в фармацевтической и пищевой отраслях промышленности. Сущность изобретения: фруктовые выжимки экстрагируют 1%-ным(51) 5 С 08 В 37 06 водным раствором оксалата аммония с одновременным измельчением до размера частиц 1 мм в смесителе. В смесителе создаются вихревые потоки Вращение рабочего вала смесителя 800 об/мин Время экстракции 10 мин Гидромодуль 1;20. Экстракт фильтруют - концентрируют в вакууме. Пектин осаждают этанолом и сушат. Затем его обрабатывают водным раствором аммиака лри рН 10,5 игидромодуле 1;102 ч, К реакционной смеси добавляют соляную кислоту до рН 2, выдерживают смесь при 18 С 1 ч и выделяют пектин. 3 ил, 2004549Изобретение относится к фармацевтической и пищевой промышленности и касается способа получения лекарственныхсредств из растительного сырья,В литературе описан способ получения 5пектина из свекловичного жома, являющегося отходом консервного производства,путем экстракции сырья сначала 1,300-нымраствором хлороводородной кислоты при75 С в течение 2 ч, затем водой при 70 С втечение 40 мин, фильтрации, объединенияэкстрактов, осаждения пектинов хлоридомалюминия при рН 6,0-6,5, очистки пектиноалюминиевого коагулята солянокислымспиртом и раствором аммония гидроксида, 15сушки.Недостатками описанного способа являются токсичность растворимых соедине:ний алюминия, используемых в качествеосадителя, токсичность хлороводородной 20кислоты, длительность и трудоемкость способа получения, низкий выход целевогопродукта и относительно малая свяэывающая способность,Для оценки связывающей способности 25пектинов при их применении в медицинских целях используется показатель - ком плексообразующая способность (КС),, которая выражает число миллиграммов катиона свинца, связанных Одним ГОаммсмпектина, Определение КС проводится путемсжигания пектината свинца с целью определения количества связавшегося металла.Пищевые пектины промышленного производства, применяемые в медицине. содержат много балластных веществ и, какправило, высокоэтерифицированы и загрязнены сопутствующими металлами, вследствие чего они обладают относительно низкойКС, Так, свекловичный пектин, полученный 40пс описанйому способу обладает КС==191,60 мг РЬ lг.Известен способ получения пектинов изпищевых выжимск путем последовательнойэкстракции сырья сначала водным раствором азотной кислоты при 70-80 С в течение3,0-3,5 мин, затем водой при 45-50 С в течение 2 ч фильтрования, объединения и концентрирования экстрактов и осаждением пектинов 960-ным этанолом в соотношении 1,3 с последующим отделением, очисткой и сушкой пектина, Выход целевого продукта 11 к массе сухого сырья, Данный способ получения пектинов наиболее близок к заявляемому. Нвдостатками приведенного способа являются недостаточно высокая КС пектинов(205,06 мг РЬ 2 /г), невысокий выход целевого продукта, использование токсичногозкстрагента (азотной кислоты). В литеоатуре имеются сведения а том,что при приеме внутрь пектины сбладастспособностью образовывать комплексы сионами токсичных, в т,ч, и радиоактивныхметаллов и выводить их из организма человека, В связи с этим совершенствованиетехнологии получения пектинов с высокойсвязывающей способностью позволит получить пектины для медицинского применения, На основе механизма связыванияпектины проявляют гипохолестеринемическое, радионуклидсвязусщее и антигипоксическое действия, т,е, пектины связывастсоответственно холестерин, радионуклидыи свободные радикалы (образующиеся прианаэробном дыхании),Заявляемый способ получения пектинов позволяет по учить пектины с высокой связывающей способностью, чтоподтверждается высокими результатамиКС, гипохолестеринемического, радионуклидсвязывающего и антигипоксическогодействия,Цель изобретения - повышение связывающей способности пектинов, повгяшениевыхода пектинов, повышение гипохолестеринемической, радионуклидсвязывающей,антигипсксической активностей.Поставленная цель достигается тем, чтов способе получения пектина из фруктовыхвьокилок, включающем экстракцио сырья,фильтрацис и вакуумное концентрирование экстракта, осаждение пектина из концентрата этанолом, промывку и сушкувыделенного пектина, экстоакцию осуществляют 1%-ным водным раствором оксалатааммония с одновременным измельчениемвыжимок до размера частиц 1 мм в слесителе, обеспечивающем создание вихревых потоков, при вращении рабочего валасмесителя 9000 сб/мин, в течение 10 мин,гидромодуле 1:20, а после сушки пектин обрабатывают водным раствором аммиакапри рН 10,5 и гидромодуле 1:10, в течение 2ч с последующим добавлением к реакционной смеси соляной кислоты до рН 2, выдерживанием смеси при 18 С в течение 1 ч ивыделением целевого продукта,В качестве объекта исследования ис 0 пользовали выжимки из цитрусовых плодов,которые являются экологически наиболеечистыми, по сравнению с другими производственными источниками полученияпектинсв (свекловичными, яблочными вы 55 жимками), и в соответствии с этим они перспективны в качестве источника получениямедицинского пектина.Б предлагаемом способе вихревая экстракция сырья - выжимок цитрусовыхплодов, осуществляется в приборе "Мель 2004549экстрактор", где одновременно происходит два процесса: измельчение и экстракция причем благодаря наличию двух пар ножей, расположенных горизонтально и под углом 45 О к рабочей оси прибора, иэмельчение сырья осуществляется в двух плоскостях - горизонтальной и наклонной, в результате чего происходит тонкое измельчение сырья до 1,0 мм с разрывом клеточных стенок, что способствует дополнительно извлечению пектинов, содержащихся в стенках клеток и внутриклеточном соке растений, а, следовательно. повышению выхода пектинов. Благодаря интенсивному перемешиванию выжимок с экстрагентом в смесителе при частоте вращения рабочего вала смесителя 8000 об,/мин, вымывание пектинов из растительных клеток интенсифицируется.Кроме того, благодаря использованию в качестве экстрагента оксалата аммония. который хелатообразно связывает катионы металлов, сопутствующих пектинам, обеспечивается частичная деминерализация пектинов, а, следовательно, и повышается их связывающая способность.Заявляемый способ обеспечивает получение цитрусового пектина с КС=922,77 мг РЬ/г. Выход пектина в предлагаемом способе составляет 21,150 к массе сухого сырья, Степень этерификации пектина составила 37,29 (нативный цитрусовый пектин имеет степень этерификации 68,57 о ), Содержание свободных карбоксильных групп 15,64 (нативный цитрусовый пектин характеризуется содержанием свободных карбоксильных групп 3,400 ).Как известно, за комплексообразование пектинов ответственны свободные карбоксильные группы, поэтому, чем ниже степень этерификации (соответственно выше содержание свободных карбоксильных групп), тем выше КС пектинов. При деметоксилировании и деминерализации происходит повышение содержания свободных карбоксильных групп и, следовательно, КС пектинов.В результате исследований подобраны оптимальные условия выделения пектинов,Способ поясняется следующими примерами;П р и м е р 1, 100 г сухих цитрусовых выжимок(кожура, цедра, семена) помещают в "Мельэкстрактор", приливают 2 л горячего 1-ного раствора оксалата аммония(темпе, ратура раствора 80 С), измельчают и перемешивают в приборе "Мельэкстрактор" при скорости вращения измельчающих. ножей 8000 об./мин в течение 10 мин до частиц сырья размером 1 мм, Затем экстракт фильтруют через тройной слой марли и ватный 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 тампон, упаривают вакуумом до 1/3 первоначального обьема, обрабатывают 96%-кым этанолом в соотношении экстракт:этанол 1;3. Выпавший осадок пектинов фильтруют под вакуумом, промывают дважды на фильтре 96%-ным этанолом (по 50 мл) и сушат пектины при 60 С в сушильном шкафу. Далее полученные 25 г цитрусового пектина растворяют в 500 мл воды (5 -ный раствор пектина), добавляют при перемешивании примерно 250 мл 5 о -ного раствора гидроксида аммония, рК смеси составил 10,5 (показатель рН определяли потенциометрически). Колбу со смесью закрывают плотной крышкой и выдерживают смесь 2 ч при комнатной температуре, При этом происходило деметоксилирование пектина, раствор приобретал форму желе, Далее, полученное желе постепенно подкисляют разбавленным (8,3 о -ным) раствором хлороводородной кислоты до рН около 2 и оставляют смесь на 1 ч при температуре 18 С в термостате. При этом выпадал осадок низкометоксилированного и деминерализованного цитрусового пектина, который фильтровали через бумажный фильтр, промывали на фильтре 96 этанолом дважды, сушилив сушильном шкафу при 60 С,Выход низкометоксилированного и деминералиэованного цитрусового пектина составил 21,15 гили 21,15% к сырью, Содержание свободных карбоксильных групп пектина - 15,64 . Степень этерификации пектина - 37,29 . КС пектина - 922,77 мг РЬ /г.Целевой продукт - низкометоксилированный и деминерализованный пектин из цитрусовых выжимок, представляет собой порошок светло-бежевого цвета. без запаха, с кисловатым вкусом, трудно растворим в воде.П р и м е р .2 (сравнительный), 100 г сухих цитрусовых выжимок помещают в "Мельэкстрактор", приливают 1,5 л горячего 0,5 -ного раствора оксалата аммония (температура раствора 80 С), измельчают и перемешивают в приборе "Мельэкстрактор" при скорости вращения измельчающих ножей 6000 об./мин в течение 8 мин до частиц сырья размером 1 мм. Затем экстракт фильтруют через тройной слой марли и ватный тампон, упаривают под вакуумом до 1/3 первоначального объема, обрабатывают 96 -ным этанолом в соотношении экстракт:зтанол 1;3. Выпавший осадок пе-,тинов фильтруют под вакуумом, промывают дважды на фильтре 96,-ным этанолом (по 50 мл) и сушат пектины при 60 С в сушильном шкафу. Далее полученные 20 г цитрусового пектина растворяют в 400 мл водычески). Колбу со смесью закрывают плотнойкрышкой и выдерживают смесь 2,5 ч при комнатной температуре, При этом происходило деметоксилировэние пектина, растворприобретал форму желе. Далее, полученное желе постепенно подкисляот разбавленным (8,3 ф,-ным) раствором хлороводородной кислоты до рН около 3 и оставлялисмесь на 1.5 ч при температуре 20 С. При этом выпадал осадок низкометоксилированного и деми нерализовэ нного цитрусово 50 55(5,-ный раствор пектина), добавляют при Г 1 еремешивании,40 мл 3 Д-ного раствора гидроксида аммония, рН смеси составил 9,8 (показатель рН определяли потенциометрически), Колбу со смесью закрывают плотной 5 крышкой и выдеркивают смесь 1,5 ч при комнатной температуре. При этом происходило деметоксилирование пектинэ, раствор приобретал форму желе. Далее полученное желе постепенно подкисляют разбавлен ным (8,3;(,-ным) раствором хлороводородной кислоты до рН около 1 и оставляют смесь на 0,5 ч при температуре 15 С в термостате. При этом выпадал осадок низкометоксилированного и деминерализованного 15 цитрусового пектина, который фильтровали через бумажный фильтр, промывали на фильтре 960/о-ным этанолом дважды, суши= ли в сушильном шкафу при 60 С.Выход низкометоксилированного и де минерализованного цитрусового пектина составил 18,12 г йли 18,12% к сырью. Содержание свободных карбоксильных групп пектина 14,97 О/о, Степень этерификации пектина 41,15, КС пектина - 902,15 мг 25 , г+/гП р и м е р 3 (сравнительный), 100 гсухих цитрусовых вьжимок помещают в "Мельэкстрактор", приливают 2,5 л горячего 1,5%-ного раствора оксалата аммония (тем пература раствора 80 С), измельчают и перемешива от в приборе "Мельэкстрактор" при скорости вращения измельчающих но.жей 10000 об./мин в течение 12 мин до частиц размером 1 мм. Затем экстракт филь- . 35 труют через тройной слой марли и ватный тампон, упариваот под вакуумом до 1/3 первоначального объема. обрабатывают 96;4-ным этэнолом в соотношении экс, тракт:этанол 1:3, Выпавший осадок пектинов фильтруют под вакуумом, промывают дважды на фильтре 96-ным этанолом (по 50 мл) и сушат пектины при 60 С в сушильном шкафу, Далее, полученные 24 г цитрусового пектинэ растворяют в 480 мл воды 45 (5-ный раствор пектина), добавляют при перемешивании 288 мл 7 Я,-ного раствора гидроксида аммония, рН смеси составил 11 (показатель рН определяли потенциометриго пектина, который фильтруют че;ез бумажный фильтр, промываот на фильтре 96%-ным этанолом дважды, сушат в сушильном шкафу прл 60 С.Выход низкометоксилированного и деминерализованного цитрусового пектинэ составил 21,10 г или 21,10% к сырью. Содержание свободных карбоксильных групп пектина 15,58%, Степень этерификации пектина 37,66)ь, КС пектина 922,57 мг РЬ /гПолученный низкометоксилированный и деминерализованный цитрусовый пектин был исследован на оструо токсйчность. Изучение острой токсичности проведено по методу Кербера на 36 белых мышах массой 30-40 г при внутр,брюшинном введении вещества. Согласно методическим рекомендациям Фармакологического комитета МЗ СССР, максимально допустимым количеством жидкости для внутриорюшиннОГО введения мышам массой 20-40 г является 1,0 мм, В этой связи исследуемое вещество вводилось мышам из расчета 1000 мг/кг в объеме 1,0 мл. После одноразового введения за состоянием животных наблюдали 14 дней. За время наблюдений гибели животных не отмечалось, что позволяет определить для пектинэ О 5 О=1000 мг/кг, Согласно классификации токсических веществ, исследуемые вещества следует отнести к группе нетоксичных веществ.1 ипохолестеринемичаское действие пектинов,Влияние различных пектиноз на уровень холестерина в крови изучалось в опытах на 71 белых крысах с гиперлипидемией, вызванной внутрибрюшинным введением таинав дозе 200 мг на 100 г массы тела животного, Одновременно с твиномопытной группе животных перорально вводили в объеме 1 мл водного раствора различные пектины из расчета 200 мг/кг: 1) деминерализованной (с помощью хлороводородной кислоты) цитрусовый пектин, 2) ниэкометоксилированкый (с помощью гидроксида аммония) цитрусовый пектин, 3) деминерализованный (с помощью катионита КУ) цитрусовый пектин,4) деминерализованный (с помощью хлороводородной кислоты) и низкометоксилированный(с помощью гидроксида аммония) цитрусовый пектин, 5) нативный цитрусовый пектин. Контрольная группа животных в аналогичных условиях вместо исследуемых веществ получалэ 1 мл воды, Через 12 ч указанные группы животных, а также группа интактных крыс забивали декапитацией и в сыворотке крови определяли содержание холестерина по Ильку, Полученне результаты обраба 2004549тывались методом вариационной статистики.Как видно из табл. 1, исследованные соединения вызвали различный эффект. Исходный цитрусовый пектин не оказал суще ственного влияния на уровень холестерина у животных с экспериментальной гиперхолестеринемией, Наибольший гипохолестеринемический эффект наблюдался от применения деминерализованного и низко метоксилированного цитрусового пектина - на 40,4% (р=-1,001), Несколько менее выраженное влияние отмечалось в опытах с деминерализованным (с помощью хлороводородной кислоты) цитрусовым пектином. 15 Деминеоализованный катионитом и, особенно, низкометоксилированный цитрусовые пектины оыли малоэффективны.Значительное усиление гипохолестеринемического действия пектинов под тверждается после деминерализации и деметоксилирования пектинов.Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о ведущей роли в проявлении гипохолестеринемического действия 25 пектинов, наличия в их структуре свободных карбоксильных групп, И в этой связи использование методов деминерализации и деметоксилирования пектинов, веду цее к повышению содержания свободных карбок сильных групп, служит эффективным способом повышения гипохолестеринемической активности лектинов,Радионуклидсвязывающая активность 35 пектинов.Испытания радионуклидсвязывающей активности (РНСА) исследуемых образов пектинов производилось по разработанной в Киевском государственном институте усо вершенствования врачей методике, которая защищена авторским свидетельством М 274598. В качестве индикатора использовался стронций,45Результаты испытаний представлены в табл.2,Полученные результаты позволяют заключить, что наиболее выраженный радионуклидсвязывающий эффект присущ 50 деминерализован ному и низкометоксилированному цитрусовому пектину, меньшей активностью обладает деминерализованный цитрусовый пектин, наименьшей - низкометоксилированный цитрусовый пектин. 55 Во всех случаях предварительно (с помощью методов деминерализации, деметоксилирования) пектины проявляли более высокую РНСА, чем исходный цитрусовый пектин. Антигипоксическая активностьПектины были изучены на модел ант- гипоксической активности, предложе",ной В,В.Гапура. Опыты проводились на мышах- самцах массой 24-25 г. Всего в опыте участвовало Зб животных. Проведено 6 серий опытов. Первая - контрольная (вводили через рот физраствор в объеме 1 мл). Вторая - стандартная (через рот вводили препарат сравнения - пирацетам в дозе 100 мг/кг, который обладает антигипоксическими свойствами. Третья серия - опытная, вводили цитрусовый пектин в дозе 100 мг/кг. Четвертая серия - опытная, вводили деминерализованный(с помощью хлороводородной кислоты) цитрусовый пектин в дозе 100 мг/кг. Пятая серия - опытная, вводили низкометоксилированный (с помощью гидроксида аммония) цитрусовый пектин в дозе 100 мг/кг, шестая серия - опытная, вводили деминерализованный (с помощью хлороводородной кислоты) и ниэкометоксилированный (с помощью гидроксида аммония) цитрусовый пектин в дозе 100 мг/кг. Физраствор, пирацетам и пектины вводили через зонд в желудок в объеме 1 мл, Все вещества вводили в течение 3 суток. Эксперимент начинали через 60 мин после последнего введения. Данные экспериментов обрабатывали статистически, результаты представлены в табл.З.Таким образом, пектины обладают выраженным антигипоксическим действием, которое достоверно выше контроля (физраствор) и эталонного препарата (пирацетам). Наиболее выраженным антигипоксическим действием обладаетдеминералиэованный и низкометоксилированный цитрусовый пектин, менее выраженным - деминерализованный, еще менее выраженным низкометоксилированный, затем - исходный цитрусовый пектин, Во всех случаях активность цитрусовых пектинов выше активности эталона (пирацетама). Таким образом, проведенные биологические исследования показали определяющую роль свободных карбоксильных групп в молекулах пектинов (особенно после обработки пектинов) в проявлении гипохолестеринемического, радионуклидосвязы вающего и антигипоксического действий, которые, по-видимому. основаны на связывающих способностях пектинов. Полученные результаты позволяют рекомендовать исследованные пектины для создания на их основе новых лечебно-профилактических средств широкого спектра действ я.Применение предложенного способа позволит;2004549 12 Таблица 1 Влияние пектинов на уровень холестерина в сыворотке крови белых крыс Условия опыта и кол-во животных(п)изм. к кОнт ОЛЮ+2,8 1. Повысить связывающую способность пектинов благодаря увеличению содержания свободных карбоксильных групп в молекулах пектинов. Если КС пектина, полученного по способу-прототипу, составляет 205,06 мг РО+/г, то КС деминерализованного и низкометоксилированного цитрусового пектина, полученного по заявляемому способу, составила 922,77 мг РЬ+/г, т,е. КС целевого продукта, полученного по заявляемому способу, в 4,5 раза,выше КС продукта, полученного в способе-прототипе.2. Повысить выход пектинов. Выход пектинов в способе-прототипе составляет 11 к сырью, в заявляемом способе - 21,15, т,е, выход пектинов в заявляемом способе выше на 10,15; выхода пектинов в способе-прототипе.3. Повысить гипохолестеринемическую, радионуклидосвязывающую и антигипоксическую активности пектинов: по сравнению Интактные животные, п=8Животные, получавшие твин(контроль), п=6 с нативным (необработанным) цитрусовым пектином, деминералиэованный и деметоксилированный цитрусовый пектин на 43,2 проявляет более высокое гипохолестерине мическое действие, на 10,58% - более высокое радионуклидсвязывающее действие, на 60 - более высокое антигипоксическое действие.4. Использование пищевых выжимок 1 О для получения пектина экономически выгодно с точки зрения существенного уменьшения себестоимости пектинов. Поэтому, заявляемый способ получения иэ выжимок пектинов, обладающих лечебно-профилак тическими свойствами, является весьмаперспектив н,ым.(56) Карпович Н,С. и др, Пектин, Производство и применение, Киев: Урожай, 1989, 20 с, 33-39.То же, с. 42-45. Холесте инсыво отки к ови, ммоль/л13 Таблица 2 Влияние пектинов на связывание радионуклидов есо б ия Со б ия й,с РНСА И,с Пс 4,63 1,50 0,15 6,94 1,25 3,7 0 2 4,74 31 5.2 7,15 О Приме Таблица Результаты антигипоксического действия пектинов контролем- показатель сорбции,- показатель десорбции в относительных единицах) Продолжительость гипоксии, переносимой животными,мин Повышение активности по сравнеию с эталоном,16 2004549 Составитель О.РокачевскаяРедактор Т,Никольская Техред М.Моргентал Корректор А,Обручар Тираж Подписное НПО "Поиск" Роспатента113035, Москва. Ж, Раушская наб., 4/5 Заказ 3377 Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород. ул,Гагарина, 101 Формула изобретенияСПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕКТИНАйз 1 фруктовых выжимок, включающий экстракцию сырья, фильтрацию и вакуумное концентрирование экстракта. осаждение пектина иэ концентрата этанолом, промыв-. ку и сушку выделенного пектина, отличающийся тем, что экстракцию осуществляют 1 -ным водным раствором оксалата аммония с одновременным йзмельчением выжимок до размера частиц 1 мм в смесителе, обеспечивающем создание вихревых потоков, при вращении рабочего вала смесителя 8000 об/мин, в течение 10 мин, при гидромодуле 1: 20, а после сушки пектин обрабатывают водным раствором аммиака при рН 10,5 и гидромодуле 1: 10 в течение 2 ч с последующим добавлением к реакционной смеси соляной кислоты до рН 2, выдерживанием смеси при 18 С в-течение 1 ч и выделением целевого продукта,.